Strumenti per l'estrazione dell'acido nucleico basati su sfere magnetiche nella preparazione delle librerie NGS

Gli strumenti per l'estrazione degli acidi nucleici basati su sfere magnetiche svolgono un ruolo fondamentale e quasi indispensabile nel sequenziamento di prossima generazione (NGS) flusso di lavoro di preparazione della libreria. Come punto di partenza dell'intero processo NGS, le loro prestazioni determinano direttamente la qualità della successiva costruzione della libreria e del sequenziamento dei dati.

Di seguito sono riportate le applicazioni principali e i vantaggi degli strumenti di estrazione dell'acido nucleico basati su sfere magnetiche nella preparazione delle librerie NGS:

Compito principale: Isolamento e purificazione di acidi nucleici di alta qualità

Diversi campioni iniziali: La preparazione delle librerie NGS inizia con una gamma estremamente ampia di tipi di campioni, compreso il sangue, plasma (DNA libero da cellule), saliva, tessuto (fresco/FFPE), cellule, microrganismi, piante, e campioni ambientali. Metodi con biglie magnetiche, grazie alla loro flessibilità e ottimizzabilità, può gestire questi campioni complessi, che spesso contengono quantità significative di inibitori.

Tipi di acidi nucleici target: Utilizzato principalmente per estrarre il DNA (DNA genomico, gDNA; DNA libero da cellule, cfDNA) o RNA (per RNA-Seq). Gruppi funzionali rivestiti sulla superficie della perla magnetica (tipicamente gruppi silanolici o specifici gruppi a scambio ionico/ligandi di affinità) legano selettivamente gli acidi nucleici in specifiche condizioni tampone.

Rimozione delle impurità: Rimuove efficacemente le proteine, lipidi, carboidrati, ioni di sale, detersivi, acidi umici (campioni ambientali), fissativi e coloranti (Campioni FFPE), e inibitori della PCR (per esempio., eparina, eme, acidi umici) dai campioni. Queste impurità possono interferire gravemente con le successive reazioni enzimatiche (per esempio., frammentazione, terminare la riparazione, dA-tailing, legatura dell'adattatore, Amplificazione PCR), portando al fallimento della preparazione della biblioteca, efficienza ridotta, o scarsa qualità dei dati di sequenziamento.

Ruoli chiave nel flusso di lavoro di preparazione della libreria NGS

Fornire puro “Materia prima” per la preparazione della biblioteca: Fasi di preparazione della libreria (frammentazione, fine riparazione/dA-tailing, legatura dell'adattatore, Amplificazione PCR) tutti richiedono acidi nucleici di elevata purezza di adeguata integrità e concentrazione sufficiente come input. L'estrazione delle sfere magnetiche è il passaggio fondamentale per garantire la qualificazione “materia prima.”

Garantire la rappresentatività e l'uniformità della biblioteca: Un recupero efficiente e uniforme dell'acido nucleico è fondamentale per mantenere la reale proporzione delle molecole di acido nucleico nel campione originale, soprattutto quando si studiano varianti a bassa frequenza, metagenomica, o trascrittomica. L'elevato tasso di recupero e la coerenza dei metodi con microsfere magnetiche aiutano a ridurre al minimo i bias.

Migliorare la percentuale di successo e l'efficienza della preparazione delle librerie: Rimuovendo gli inibitori, i costosi enzimi utilizzati nella preparazione delle biblioteche (per esempio., polimerasi, ligasi) possono funzionare in modo più efficace, riducendo il rischio di inattivazione enzimatica o di reazioni incomplete, aumentando così la resa e la qualità della biblioteca.

Soddisfare i requisiti di campionamento a basso input: Per prezioso, campioni a bassa quantità come il cfDNA, campioni di sequenziamento di singole cellule, o biopsie con ago, metodi con perline magnetiche, grazie alla loro elevata efficienza legante e tasso di recupero (soprattutto con kit ottimizzati), può ottenere acidi nucleici sufficienti per la preparazione delle librerie da un materiale di partenza minimo.

Gestione di campioni impegnativi: Esistono kit e protocolli di sfere magnetiche appositamente ottimizzati per campioni complessi come FFPE (contenente DNA reticolato e frammentato, oltre ad alti livelli di fissativi/coloranti), campioni di terreno/ambientali (contenenti inibitori complessi), e campioni di piante ricche di polisaccaridi/polifenoli, consentendo un'efficace lisi cellulare/tissutale e la purificazione degli acidi nucleici utilizzabili.

Vantaggi principali degli strumenti per l'estrazione dell'acido nucleico con sfere magnetiche (Perché sono preferiti per NGS)

Automazione & Elevata produttività:

Vantaggio fondamentale: Gli strumenti possono elaborare più campioni contemporaneamente (da poche piastre a 96/384 pozzetti), consentendo operazioni standardizzate. Questo è fondamentale per i progetti NGS che richiedono grandi volumi di campioni (per esempio., studi sulla popolazione, test clinici), aumentando significativamente la produttività e l’efficienza.

Errore umano ridotto: L'automazione riduce al minimo i rischi di variabilità e contaminazione derivanti dalla movimentazione manuale, migliorare la coerenza e la riproducibilità dei risultati.

Funzionamento semplice e rapido: Rispetto ai metodi tradizionali con fenolo-cloroformio o colonna spin, i metodi con perline magnetiche su strumenti automatizzati comportano meno passaggi (lisi-legare-lavare-eluire), offrire un flusso di lavoro più semplice, e ridurre drasticamente i tempi di estrazione (tipicamente 30-60 minuti per lotto).

Elevata purezza e resa: La chimica della superficie delle sfere magnetiche ottimizzate e i sistemi tampone consentono un'efficienza, legame e lavaggio specifici degli acidi nucleici, rimuovendo efficacemente le impurità per ottenere elevata purezza, acidi nucleici ad alta concentrazione che soddisfano i rigorosi requisiti di qualità degli input di NGS (per esempio., A260/A280, Rapporti A260/A230, concentrazione, distribuzione delle dimensioni dei frammenti).

Flessibilità: Cambiando diverse perle e kit magnetici, lo stesso strumento può adattarsi a diverse tipologie di campione (sangue, tessuto, cellule, FFPE, microbi, ecc.) e tipi di acidi nucleici (DNA, RNA, acido nucleico totale), e può persino integrare le fasi di digestione della DNasi.

Sistema chiuso & Basso rischio di contaminazione: Gli strumenti automatizzati tipicamente gestiscono i liquidi in un ambiente relativamente chiuso o semichiuso. Combinato con la cattura magnetica delle perle (nessuna colonna o centrifugazione ripetuta/tappi aperti), ciò riduce significativamente il rischio di contaminazione incrociata tra campioni e contaminazione da aerosol.

Scalabilità: Strumenti con diverse capacità di throughput (per esempio., 8, 16, 32, 96 pozzi) possono essere selezionati in base alle esigenze del laboratorio.

Sicurezza: Evita l'uso di solventi organici tossici come il fenolo-cloroformio, rendendolo più sicuro e rispettoso dell’ambiente.

Integrazione facile: Le moderne stazioni di lavoro automatizzate possono integrare l'estrazione dell'acido nucleico con sfere magnetiche con le successive fasi di preparazione delle librerie (per esempio., frammentazione, trattamenti enzimatici, purificazione) e persino quantificazione, consentendo la completa automazione “campionamento, biblioteca-out” flussi di lavoro.

Esempi di scenari applicativi

Sequenziamento dell'intero genoma (WGS): Estrazione di gDNA di alta qualità dal sangue, saliva, o tessuto.

Sequenziamento dell'intero esoma (WES): Richiede anche gDNA di alta qualità come materiale di partenza.

Sequenziamento mirato: Estrazione di acidi nucleici da vari campioni per il sequenziamento di regioni geniche specifiche.

Sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq): Estrazione di RNA totale o mRNA di alta qualità per l'analisi del trascrittoma.

Sequenziamento metagenomico: Estrazione del DNA totale della comunità microbica da campioni ambientali (suolo, acqua, contenuto intestinale) o campioni clinici (tamponi respiratori).

DNA libero da cellule (cfDNA) Sequenziamento: Estrazione di tracce di cfDNA da plasma o siero per test prenatali non invasivi (NIPT) o biopsia liquida per il cancro.

Sequenziamento di singole cellule: Estrazione di piccole quantità di DNA genomico o RNA da singole cellule lisate.

Sequenziamento dei campioni FFPE: Estrazione di DNA frammentato da tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina per studi retrospettivi o diagnostica clinica.

Considerazioni sulla selezione e sull'utilizzo

Corrispondenza del kit: È necessario selezionare kit di sfere magnetiche ottimizzati per il tipo di campione specifico e il tipo di acido nucleico.

Prestazioni dello strumento: Considerare la produttività dello strumento, efficienza di assorbimento del magnete, precisione nella gestione dei liquidi, controllo della contaminazione crociata, tempo di esecuzione, ecc.

Qualità delle perle: Uniformità delle dimensioni delle perle, forza magnetica, stabilità del rivestimento superficiale, e la capacità di legare gli acidi nucleici sono cruciali.

Efficienza di lisi: Per campioni complessi (per esempio., tessuto, Batteri Gram-positivi, spore), una lisi efficiente è un prerequisito per un’estrazione di successo e può richiedere condizioni di lisi ottimizzate o moduli di lisi speciali.

Volume di eluizione: Volumi di eluizione più piccoli aiutano a raggiungere concentrazioni elevate di acido nucleico ma richiedono di garantire una dissoluzione completa senza perdite.

Inibitori residui: Anche con i metodi con perle magnetiche, in alcuni campioni possono rimanere tracce di inibitori (per esempio., sgabello, suolo, FFPE), che richiedono particolare cautela o diluizione nelle successive fasi della PCR della libreria.

Riepilogo:

Strumenti per l'estrazione degli acidi nucleici a base di sfere magnetiche, con la loro automazione, rendimento elevato, velocità, efficienza, elevata purezza, semplicità di funzionamento, sicurezza, e flessibilità, sono diventate la tecnologia di purificazione degli acidi nucleici predominante nei flussi di lavoro di preparazione delle librerie NGS. Forniscono il puro, affidabile, e acido nucleico uniforme “materia prima” essenziale per la costruzione di librerie NGS di alta qualità, fungendo da pietra angolare per flussi di lavoro NGS di successo e dati di sequenziamento affidabili. Sia per la ricerca di base che per la diagnostica clinica, L’estrazione automatizzata dell’acido nucleico dalle sfere magnetiche è un passaggio chiave indispensabile.

Fornitore

Shanghai Lingjun Biotecnologia Co., Ltd.è stato fondato nel 2016 che è un produttore professionale di materiali biomagnetici e reagenti per l'estrazione degli acidi nucleici.

Abbiamo una ricca esperienza nell'estrazione e purificazione degli acidi nucleici, purificazione delle proteine, separazione cellulare, chemiluminescenza, e altri campi tecnici.

I nostri prodotti sono ampiamente utilizzati in molti campi, come i test medici, test genetici, ricerca universitaria, allevamento genetico, e così via. Non solo forniamo prodotti, ma possiamo anche intraprendere l'OEM, ODM, e altre esigenze. Se hai un'esigenza correlata, non esitate a contattarci .