Come utilizzare la tecnologia di selezione di frammenti di DNA di grandi dimensioni nel sequenziamento NGS

La tecnologia di selezione dei frammenti di DNA di grandi dimensioni svolge un ruolo fondamentale nel sequenziamento NGS, in particolare nel rilevamento di varianti strutturali, assemblaggio del genoma, e analisi dell'aplotipo. Di seguito sono elencate le sue applicazioni principali e i principi tecnici:：

IO. Scenari applicativi

Variante strutturale (SV) Rilevamento

Sfida: Sequenziamento convenzionale a lettura breve (per esempio., Illumina) fatica a catturare con precisione le varianti >1 kb (inserimenti, eliminazioni, inversioni, traslocazioni).

Soluzione: Selezionando grandi frammenti di DNA (10–50KB) per la costruzione della biblioteca, combinato con sequenziamento a lettura lunga (PacBio/Nanoporo) o analisi di lettura collegata, è possibile risolvere SV complessi che abbracciano regioni ripetitive.

Esempio: Eventi di fusione nei genomi del cancro (per esempio., *ALK-EML4*) spesso richiedono dati frammentari di grandi dimensioni.

Assemblaggio del genoma di alta qualità

Sfida: I dati di lettura breve spesso portano a errori di assemblaggio in regioni ripetitive, provocando la frammentazione del genoma.

Soluzione: Grandi frammenti (per esempio., Biblioteche di fosmidi) fornire collegamenti fisici a lungo raggio, consentendo il montaggio continuo di impalcature (5–Miglioramento di 10 volte in N50).

Esempio: Il Consorzio T2T ha riempito la finale 8% lacuna nel genoma di riferimento umano utilizzando tecnologie Hi-C e ultra-long-read.

Fase dell'aplotipo

Sfida: Il sequenziamento a lettura breve non riesce a preservare il collegamento allelico nei siti eterozigoti.

Soluzione: Tecnologie basate su codici a barre (per esempio., 10Genomica X) ricostruire blocchi di aplotipi che coprono centinaia di kb.

Valore: Fondamentale per la tipizzazione HLA e l'identificazione dei collegamenti genetici che causano malattie.

II. Tecnologie di selezione del nucleo

1. Metodi di separazione fisica

Elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE): Separa i frammenti >50 kb per lo screening di campioni metagenomici o complessi.

Selezione della perlina magnetica (SPRIseleziona): Recupera dimensioni di frammenti specifici (per esempio., 0.1–10KB o >15 kb) regolando i rapporti tra microsfere e campione.

2. Arricchimento basato su codici a barre

10X Genomica Cromo: Incapsula frammenti di DNA in goccioline d'olio, etichettare letture brevi dallo stesso frammento di grandi dimensioni con codici a barre.

TELL-Seq/Letture collegate: Utilizza la microfluidica per la ricostruzione virtuale di frammenti lunghi 50% costo inferiore a 10X.

3. Amplificazione basata sulla circolarizzazione

Genomica del ciclo: I frammenti di DNA vengono circolarizzati e amplificati tramite la replicazione del cerchio rotante, preservare l’adiacenza fisica per le piattaforme NGS standard.

III. Vantaggi rispetto. Metodi convenzionali

IV. Sfide e ottimizzazione

È richiesta un'elevata qualità del DNA: Ha bisogno di DNA intatto (DV200 >50%), incompatibile con campioni FFPE allo sviluppo di kit di estrazione a basso danno.

Controllo dei costi: Il sequenziamento a lettura lunga rimane costoso per le strategie ibride (per esempio., Letture collegate e Illumina) ridurre i costi.

Aggiornamenti bioinformatici: Sono necessari strumenti specializzati (per esempio., Canu per il montaggio, HapCUT2 per la messa in fase).

V. Applicazioni rappresentative

Tracciamento del COVID-19: Sequenziamento di nanopori e selezione di sfere magnetiche (>20 frammenti di kb) genomi SARS-CoV-2 risolti rapidamente ed eventi di ricombinazione.

Diagnosi di malattie genetiche: 10X Genomics ha rilevato l'esone SMN1 7 eliminazioni, evitando interferenze da SMN2.

Genomica vegetale: Nell'assemblaggio del genoma dell'orzo, Biblioteche BAC (40–100KB) aumentato Contig N50 a 486 kb.

Conclusione

La selezione di grandi frammenti di DNA supera i limiti dell'NGS a lettura breve fornendo un contesto genomico a lungo raggio. Con i progressi nei codici a barre (per esempio., TELL-Seq) e piattaforme localizzate (per esempio., MGI CoolMPS), questa tecnologia accelererà le applicazioni nella diagnostica clinica, studi evoluzionistici, e allevamento di precisione.

Fornitore

Shanghai Lingjun Biotecnologia Co., Ltd.è stato fondato nel 2016 che è un produttore professionale di materiali biomagnetici e reagenti per l'estrazione degli acidi nucleici.

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