Бережное обращение: Не подлежащий обсуждению базовый уровень для выбора фрагмента ДНК

Предисловие

В процессе отбора фрагментов ДНК магнитных шариков на основе диоксида кремния, операторы сталкиваются с, казалось бы, противоречивым требованием: они должны обеспечить тщательное смешивание шариков и ДНК для эффективного связывания при сохранении “чрезвычайная мягкость” во избежание какого-либо сильного физического возбуждения.. Многие экспериментаторы недооценивают важность последнего., считая это просто обычным советом по предотвращению разливов. Однако, научные данные ясно показывают, что физическое стрижка является тихим «убийцей».’ приводящие к ухудшению качества селекционной продукции, невоспроизводимые результаты, и даже неудачный эксперимент. В этой статье мы углубимся в основные молекулярные механизмы и предоставим строгий набор операционных стандартов против сдвига..

1. Основной научный принцип: Молекулы ДНК представляют собой хрупкие линейные полимеры

ДНК не является жестким стержнем, а существует в растворе как гибкая, длинноцепной полимер в конформации случайного клубка. Его устойчивость к силам сдвига жидкости., описанный в физических терминах, зависит от его продолжительности существования (примерно 50 нм) и его контурная длина (общая длина).

Источники поперечной силы: Такие операции, как энергичное встряхивание, быстрое пипетирование с принудительной аспирацией и дозированием, и многократное пипетирование через тонкие кончики пипеток (особенно если пипетки настроены на высокие скорости) генерировать мощные ламинарные или турбулентные силы сдвига внутри жидкости.

Механизм стрижки: Когда градиент сдвига жидкости применяется к расслабленному, длинная цепочка ДНК, разные сегменты цепи тянутся в разных направлениях и с разной скоростью.. Когда эта растягивающая сила превышает механическую прочность цепи ДНК (особенно предел допуска фосфодиэфирных связей), цепь подвергается неспецифическому разрыву в наиболее механически слабых местах.

Хрупкость, зависящая от длины: Чем длиннее цепь ДНК, чем больше его гидродинамический радиус и тем больший перепад напряжений он испытывает в поле сдвигового потока., делая его более восприимчивым к сдвигу. Длинный фрагмент >10 кб можно разделить на несколько случайных 1-3 фрагменты КБ, и даже 300 целевой фрагмент bp можно разрезать на бесполезные короткие куски.

2. Катастрофическое влияние сдвига на результаты отбора фрагментов

Введение неспецифического сдвига в эксперимент, предназначенный для отбора ДНК по длине, равносильно загрязнению образца в его источнике.. Последствия носят системный и разрушительный характер.:

2.1 Целевой фрагмент “Исчезновение” и резкое падение восстановления

Фрагмент конкретной длины, который вы хотите выбрать (например, 450 б.п.) может быть случайно расколот во время обращения, уменьшение количества молекул в этом диапазоне размеров. Это напрямую проявляется в том, что уровень восстановления намного ниже ожиданий..

2.2 Ухудшение чистоты и разрешения продукта

Случайные короткие фрагменты, образующиеся при сдвиге, становятся новыми примесями.. Они могут: А) Конкурировать с целевыми фрагментами за сайты связывания во время отбора., мешая нормальной кинетике отбора; Б) Ошибочно восстановлены, поскольку их длина может попасть в окно выбора., что приводит к расширению распределения конечного продукта по длине., появление ложных пиков, повышенная базальная линия на электрофорограмме, и сильно ухудшилось разрешение.

2.3 Введение неотслеживаемой переменной, Уничтожение воспроизводимости

Степень сдвига во многом зависит от интенсивности конкретного обращения., переменная, которую трудно измерить количественно и которая варьируется от человека к человеку и время от времени. Это приводит к необъяснимым различиям в результатах между разными операторами., или даже между разными партиями одного и того же оператора, полностью разрушая воспроизводимость эксперимента и делая бессмысленной последующую оптимизацию и анализ данных..

3. Операции высокого риска, которых следует избегать, и стандартные протоколы щадящего обращения

На основе вышеизложенных принципов, мы устанавливаем следующие обязательные правила экспериментальной эксплуатации:

3.1 Запрещенные предметы (Операции высокого риска):

Энергичное вортексирование: Абсолютно запретить вихревое перемешивание пробирок, содержащих ДНК или комплексы ДНК-шарики..

Высокоскоростное/сильное встряхивание: Использование слишком высоких скоростей вращения (>1000 об/мин) на шейкере/миксере.

Принудительное повторное пипетирование: Стремительный, принудительная повторная аспирация и дозирование кончиком пипетки на дно пробирки или в пузырьки жидкости в попытке перемешать или ресуспендировать.

Использование стандартных тонких насадок для работы с образцами больших фрагментов: Использование необрезанного, тонкие наконечники для дозирования длинных фрагментов ДНК или комплексов шариков.

3.2 Стандартный рабочий протокол (СОП по бережному обращению):

Операции смешивания/ресуспендирования:

Предпочтительный метод: Мягкое инверсионное перемешивание. Надежно закройте пробирку и медленно выполняйте, повторные инверсии на 180 градусов вручную или с помощью устройства.

Альтернативный метод: Используйте широкоствольное (резать) советы для медленных, бережное перемешивание пипеткой. Отрежьте узкий конец кончика пипетки стерильными ножницами, чтобы образовалось большое отверстие., затем медленно аспирируйте и выдавите жидкость, избегая образования пузырей на протяжении всего.

Операции пипетирования:

Используйте широкоствольное (резать) или насадки с широким отверстием с низкой фиксацией для всех этапов.

Отрегулируйте скорость пипетки: Установите современные электронные пипетки на самую низкую скорость как для аспирации, так и для дозирования..

Медленное добавление вдоль стены: При добавлении реагентов, позволить потоку жидкости медленно стекать по стенке трубки, избегая прямого воздействия на поверхность жидкости или массу гранулированных шариков.

3.3 Замечания по обращению с конкретными бортами:

Ресуспендирование гранул из шариков: После снятия пробирки с магнитной стойки, если необходимо ресуспендирование шариков для промывки, добавьте буфер и ресуспендируйте путем осторожного переворачивания или осторожного перемешивания пипеткой, как описано выше.. Вортексирование строго запрещено.

Перенос супернатанта: После разделения на магнитной стойке, при аспирации супернатанта, держите кончик пипетки подальше от собранных гранул, чтобы не прикасаться к ним и не потревожить их..

4. Расширенная проверка: Как убедиться, что с вами обращаются достаточно бережно?

Если вы подозреваете, что стрижка повлияла на прошлые результаты, вы можете провести следующие проверочные эксперименты:

4.1 Контрольный эксперимент:

Возьмите тот же образец длиннофрагментной ДНК. (например, нефрагментированная геномная ДНК ) и разделил его на две порции. Подвергните одну аликвоту стандарту “нежное обращение” процедуры. Подвергните другого симулированному неправильному обращению (например, вихревой несколько раз). Затем проанализируйте оба варианта одновременно с помощью импульсного гель-электрофореза или анализатора длинных фрагментов высокого разрешения. . Видимое размытие или уменьшение интенсивности основной полосы свидетельствует о сдвиге..

4.2 Мониторинг выбора профилей продуктов

В рутинных селекционных экспериментах, если электрофореграмма конечного продукта постоянно показывает необъяснимые “горбы” или возвышение базовой линии в области коротких фрагментов (например, <100 б.п.), Операционный сдвиг является основным подозреваемым после исключения загрязнения ферментами и реагентами..

4.3 Заключение: Подъемный “Мягкость” от предложения к обязательному стандарту процесса

При выборе фрагментов ДНК и всех операциях с участием интактных молекул нуклеиновой кислоты., “мягкость” это не дополнительная мера предосторожности, а основной параметр процесса, который необходимо разработать, стандартизированный, и строго соблюдается. Это гарантирует не только успех отдельного эксперимента, но и основу надежности и воспроизводимости данных для всего исследовательского проекта..

The Линджун Био 220012 Серия высокоэффективных магнитных шариков на основе диоксида кремния., с их превосходными суспензионными свойствами и однородной монодисперсностью., добиться быстрого и гомогенного диспергирования при осторожном переворачивании, значительно снижает риск необходимости прибегать к энергичному перемешиванию для достижения адекватного перемешивания. Выбрав наш продукт и объединив его со строгими эксплуатационными протоколами, описанными здесь., you will be able to maximize the protection of your precious sample integrity, ensuring that fragment selection technology delivers true, clear, and reproducible molecular information for your research.

Поставщик

Шанхайская биотехнологическая компания Линцзюнь., ОООбыл создан в 2016 который является профессиональным производителем биомагнитных материалов и реагентов для экстракции нуклеиновых кислот..

Мы имеем богатый опыт в экстракции и очистке нуклеиновых кислот., очистка белка, разделение клеток, хемилюминесценция, и другие технические области.

Наша продукция широко используется во многих областях., например, медицинское тестирование, генетическое тестирование, университетские исследования, генетическое разведение, и так далее. Мы не только поставляем продукцию, но и можем взять на себя OEM, ОДМ, и другие потребности. Если у вас есть соответствующая потребность, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам .