Teknisk optimalisering av total RNA-ekstraksjon fra komplekse dyrevev: Evaluering av en mini-ekstraksjonsprotokoll basert på den magnetiske perlemetoden

1.Abstrakt

Visceralt vev fra dyr (slik som leveren, nyre, hjerte, og tarmvev) er rike på endogene nukleaser, polysakkarider, lipider, og bindevevskomponenter. Som et resultat, utvinning av totalt RNA fra disse vevene har lenge stått overfor tekniske utfordringer som høy risiko for nedbrytning, lav produktrenhet, og ustabile avlinger. Den tradisjonelle fenol-kloroform-ekstraksjonsmetoden er ikke bare tungvint og tidkrevende, men involverer også giftige organiske reagenser, gjør det vanskelig å møte kravene til høykapasitet og automatiserte eksperimenter.

Basert på applikasjonsdata fra Shanghai Lingjun Biotech Universal Total RNA Extraction Kit (Magnetisk perlemetode) i forskjellige dyrs viscerale prøver, denne artikkelen evaluerer systematisk ytelsen i småvolumsekstraksjoner. Resultatene indikerer at settet effektivt fjerner protein- og polysakkaridforurensning. A260/A280- og A260/A230-forholdet til det ekstraherte RNA-materialet oppfyller begge kvalitetskravene for nedstrøms molekylærbiologiske eksperimenter, og utbyttet er tilstrekkelig for ulike bruksområder, slik som RT-qPCR og transkriptomisk sekvensering, gir en sikker og effektiv løsning for RNA-ekstraksjon fra komplekse vevsprøver.

2.Introduksjon

Integriteten og renheten til ribonukleinsyre (RNA) er kritiske forutsetninger for molekylærbiologiske eksperimenter som genekspresjonsanalyse, transkriptomisk sekvensering, og ikke-kodende RNA-forskning. Visceralt vev fra dyr - spesielt leveren, nyrer, hjerte, og tarmer - regnes vanligvis som "vanskelige prøver" for RNA-ekstraksjon. Leveren er rik på glykogen og endogene RNaser; nyre- og tarmvev inneholder store mengder polysakkarider og proteolytiske enzymer; og hjertet, på grunn av den tette strukturen til muskelfibrene, lyser ikke tilstrekkelig. Disse faktorene kan alle føre til RNA-nedbrytning, lavt utbytte, eller samtidig rensing av urenheter, som igjen påvirker omvendt transkripsjonseffektivitet og påliteligheten til kvantifiseringsresultater.

De siste årene, den magnetiske kulemetoden for nukleinsyreekstraksjon har gradvis dukket opp som et alternativ til tradisjonelle sentrifugeringskolonne- og organiske løsemiddelmetoder, takket være fordelene med driftssikkerhet, enkel automatisering, og konsekvent produktkvalitet. Denne studien evaluerte ytelsen til et universelt total-RNA-ekstraksjonssett basert på den magnetiske perlemetoden, utviklet av Shanghai Lingjun Biotechnology, i viscerale prøver fra griser og mus, å gi en systematisk teknisk referanse for RNA-ekstraksjon fra slike prøver.

3.Produkttekniske prinsipper

Dette settet er basert på overflatemodifisert magnetisk perleteknologi og bruker selektiv adsorpsjon av nukleinsyrer av magnetiske perler i et spesifikt buffersystem for å rense RNA. Utvinningsprosessen inkluderer: frigjør totalt RNA fra prøven ved å bruke en lyseringsbuffer; spesifikk binding av nukleinsyrer til de magnetiske kulene; fjerning av protein- og saltion-urenheter ved bruk av vaskebuffere; og eluering med en nukleasefri vask for å oppnå høyrent RNA. Dette systemet krever ikke bruk av organiske løsningsmidler som fenol og kloroform, og unngår dermed helserisikoen og avfallsbyrdene forbundet med tradisjonelle metoder. I tillegg, den magnetiske perlemetoden forhindrer kolonnetilstopping forårsaket av prøvepartikler under sentrifugeringsbasert filtrering, og tilbyr fleksible elueringsvolumer (30–100 μL), gjør den egnet for konsentrasjon og gjenvinning av lavkonsentrasjons-RNA-prøver.

4.Eksperimentelle data og analyse

Omtrent 5–10 mg hver fiskelever, tarmvev, gjeller, og hjertet ble samlet og ekstrahert ved bruk av Lingjun Biotech Universal Total RNA Small-Volume Extraction Kit. Resultatene er vist i tabellen nedenfor.

Ingen.	Prøve	260/280	260/230	Kons. (ng/μL)
1	5 mg fiskelever	1.92	1.54	272.95
2	10mg Fisketarm	1.84	2.04	119.15
3	10mg Fiskegjelle	1.92	2.13	276.15
4	10mg Fiskehjerte	1.89	1.89	113.70

Elektroforeseresultater：

Som man kan se, A260/280-forholdene er over 1.9, konsentrasjonene er alle over 100 ng/μL, og hovedbandet er godt synlig.

5.Diskusjon og anbefalinger for søknad

5.1 Tekniske fordeler med den magnetiske perlemetoden

Sammenlignet med den tradisjonelle Trizol-metoden, den magnetiske perlemetoden reduserer behandlingstiden betydelig (hele prosessen kan fullføres under 40 minutter) og minimerer risikoen for RNA-nedbrytning på grunn av eksponering under prosedyren. I tillegg, den magnetiske perlemetoden er kompatibel med automatiserte nukleinsyreekstraksjonsplattformer, gjør den egnet for prøvebehandling med høy gjennomstrømning.

5.2Utvinningsstrategi

Lite volum ekstraksjon er egnet for rutineanalyser som RT-qPCR, cDNA-bibliotekkonstruksjon, og Northern blot; den krever bare en liten mengde prøve og er ideell for den første screeningen av dyrebare prøver. For vev med høyt fettinnhold eller høye RNase-nivåer (slik som bukspyttkjertelen), mengden lyseringsbuffer kan økes passende eller en RNase-hemmer kan tilsettes på forhånd for å optimalisere ekstraksjonseffektiviteten.

6.Konklusjon

Shanghai Lingjun Biotech Universal Total RNA Extraction Kit (Magnetisk perlemetode) viser utmerket renhet, avkastning, og brukervennlighet ved ekstraksjon av RNA fra animalsk visceralt vev. Dette systemet gir en teknisk løsning som kombinerer effektivitet og kvalitet for RNA-forskning på komplekse biologiske prøver, og det resulterende RNA er egnet for et bredt spekter av nedstrømsapplikasjoner, fra RT-qPCR til transkriptomisk sekvensering.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ble etablert i 2016 som er en profesjonell produsent av biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraksjonsreagenser.

Vi har rik erfaring innen utvinning og rensing av nukleinsyre, proteinrensing, celleseparasjon, kjemiluminescens, og andre tekniske felt.

Våre produkter er mye brukt på mange felt, som medisinsk testing, genetisk testing, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke bare produkter, men kan også påta oss OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relatert behov, ta gjerne kontakt med oss .