كيفية استخراج الخلايا المنوية RNA بكفاءة?

استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الكلي العالمي يمثل استخراج الحمض النووي الريبوزي عالي الجودة من خلايا الحيوانات المنوية مشكلة لأن هذه التجربة تتطلب اهتمامًا كبيرًا بالتفاصيل التشغيلية بسبب البنية الفريدة لخلايا الحيوانات المنوية (غشاء الخلية الصعبة, غنية بالبروتينات النووية, محتوى منخفض من الحمض النووي الريبي (RNA)., وقابلية عالية للتدهور), مما يتطلب معاملة خاصة.

1.المبدأ الأساسي:

تعتمد طريقة الخرز المغناطيسي على كريات مجهرية مغناطيسية مغلفة بمجموعة هيدروكسيل السيليكون. في ظل ظروف عالية الملح ومنخفضة الرقم الهيدروجيني, هذه الخرزات تربط الحمض النووي الريبي (RNA) على وجه التحديد. تتم إزالة الشوائب من خلال الفصل المغناطيسي, ويتم التخلص من الحمض النووي الريبي النقي في محلول قليل الملح, بيئة ذات درجة حموضة عالية.

2. الاستعدادات الخاصة قبل التجربة

2.1 جمع العينات وحفظها (حاسم لنجاح استخراج الحمض النووي الريبي للحيوانات المنوية)

• تعتبر عينات السائل المنوي الطازجة مثالية. إذا كان التخزين ضروريا, وضع العينة على الفور في محلول الحفاظ على الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال, رناليتس), احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل, ومن ثم نقل إلى -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تجنب التجميد المباشر, حيث أن بلورات الثلج يمكن أن تعطل بنية الخلية وتتحلل الحمض النووي الريبي (RNA)..
• تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.

2.2 إعداد الكاشف الرئيسي

• استخدم مجموعة مخصصة لاستخراج الحمض النووي الريبي للحيوانات المنوية مُحسّنة تجاريًا للحيوانات المنوية أو العينات الصعبة.
• تطهير ريبونوكلياز: رش أسطح العمل والماصات باستخدام RNase Zap, وارتداء القفازات والقناع. استخدام نصائح خالية من ريبونوكلياز وأنابيب الطرد المركزي.
• عامل التخفيض (دي تي تي): أغشية الخلايا المنوية غنية بروابط ثاني كبريتيد. دي تي تي (ديثيوثريتول) أمر بالغ الأهمية لتحلل. تأكد من أن المجموعة تتضمن DTT أو قم بإعدادها بنفسك (تركيز العمل المشترك: 100 مم).
• الدناز أنا: خلايا الحيوانات المنوية غنية بالحمض النووي. خطوة الهضم الدناز ضرورية لإزالة تلوث الحمض النووي الجينومي.

2.3 التبريد المسبق:

• ما قبل تبريد أجهزة الطرد المركزي والدوارات 4 درجه مئوية

3. إجراءات التشغيل القياسية (باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي الشاملة الشاملة لشركة Shanghai Lingjun للتكنولوجيا الحيوية كمثال)

اتبع التعليمات التفصيلية للدليل بعناية فيما يتعلق بالاستخراج اليدوي أو أدوات استخراج الحمض النووي الآلية.

4. تقييم الجودة

بعد الاستخراج, فمن الضروري لتقييم نوعية الحمض النووي الريبي:

4.1 التركيز والنقاء:

ينبغي أن يكون للحمض النووي الريبي عالي الجودة نسبة A260/A280 بين 1.8 و 2.1, ونسبة A260/A230 أكبر من 2.0.

4.2 نزاهة (الأكثر أهمية):

اجيلنت Bioanalyzer أو TapeStation: هذا هو المعيار الذهبي. بسبب غياب قمم RNA الريباسي 18S و28S, يختلف المظهر الكهربي للحمض النووي الريبي (RNA) الكلي للحيوانات المنوية عن نظيره في الحمض النووي الريبي (RNA) الخلوي النموذجي.

يجب أن يُظهر الحمض النووي الريبي المنوي عالي الجودة قممًا متميزة تبلغ حوالي 2000 nt و~ 100 nt (تمثل mRNA والحمض النووي الريبي (RNA) الصغير, على التوالى), مع خط أساس مستقر. مؤشر التدهور (DV200) يجب أن يكون أعلاه 60% (الأعلى, كلما كان ذلك أفضل).

التقليدي الاغاروز هلام الكهربائي: يمكن ملاحظة اللطاخة, لكنها لا تستطيع تقييم النزاهة بدقة أو اكتشاف جزيئات RNA الصغيرة.

5. الاعتبارات الرئيسية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

5.1 عائد منخفض:

الأسباب: تحلل غير كامل, عدم كفاية تركيز DTT / وقت الحضانة, انخفاض عدد الخلايا البداية, عدم كفاية ربط الخرزة المغناطيسية أو الشطف.

الحلول: ضمان دوامة شاملة أثناء التحلل; زيادة تركيز DTT أو وقت التحلل; زيادة حجم العينة البداية; تحسين حجم المخزن المؤقت شطف ودرجة الحرارة.

5.2 تلوث الحمض النووي:

الأسباب: عملية هضم DNase I غير نشطة أو غير كاملة.

الحلول: تأكد من أن DNase I جديد وفعال; تضمين خطوة إضافية لإزالة DNase (على سبيل المثال, إضافة EDTA وتعطيله عن طريق التسخين).

5.3 تدهور الحمض النووي الريبي:

الأسباب: تلوث ريبونوكلياز, درجات حرارة التشغيل مرتفعة بشكل مفرط, دورات تجميد وذوبان متكررة للعينات.

الحلول: التقيد الصارم ببروتوكولات إزالة التلوث RNase; تنفيذ كافة الخطوات على الجليد; استخدام عينات طازجة أو محفوظة بشكل صحيح.

5.4 نسبة A260/A230 منخفضة:

الأسباب: أيونات الملح المتبقية أو المذيبات العضوية (على سبيل المثال, الإيثانول).

الحلول: قم بتمديد وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقائق مع فتح الأنبوب بعد الغسيل; ضمان الإزالة الكاملة لمحلول الغسيل النهائي.

ملخص

يكمن مفتاح النجاح في استخراج الحمض النووي الريبي للحيوانات المنوية عالي الجودة في تحليل DTT الفعال, إزالة gDNA شاملة, والتحكم الصارم في RNase. من خلال اتباع تعليمات المجموعة والاهتمام بالتفاصيل المذكورة أعلاه, سيكون لديك فرصة كبيرة للنجاح.

مزود

شركة شنغهاي لينغجون للتكنولوجيا الحيوية, المحدودة.تأسست في 2016 وهي شركة متخصصة في تصنيع المواد المغناطيسية الحيوية وكواشف استخلاص الحمض النووي.

لدينا خبرة غنية في استخراج وتنقية الحمض النووي, تنقية البروتين, فصل الخلايا, التألق الكيميائي, وغيرها من المجالات التقنية.

منتجاتنا تستخدم على نطاق واسع في العديد من المجالات, مثل الفحوصات الطبية, الاختبارات الجينية, البحوث الجامعية, التكاثر الوراثي, وهكذا. نحن لا نقدم المنتجات فحسب، بل يمكننا أيضًا إجراء تصنيع المعدات الأصلية, أوديإم, وغيرها من الاحتياجات. إذا كان لديك حاجة ذات صلة, لا تتردد في الاتصال بنا .