Как эффективно извлечь РНК из сперматозоидов?

С использованием Универсальный набор для экстракции тотальной РНК извлечь качественную РНК из сперматозоидов проблематично, поскольку этот эксперимент требует большого внимания к деталям работы из-за уникальной структуры сперматозоидов. (жесткая клеточная мембрана, богат нуклеопротеинами, низкое содержание РНК, и высокая склонность к деградации), требующие специального обращения.

1.Основной принцип:

Метод магнитных шариков основан на использовании магнитных микросфер, покрытых гидроксильной группой кремния.. В условиях высокого содержания солей и низкого pH, эти шарики специфически связывают РНК. Примеси удаляются посредством магнитной сепарации., и чистая РНК элюируется в среде с низким содержанием соли., среда с высоким pH.

2. Специальная подготовка перед экспериментом

2.1 Сбор и сохранение образцов (Критически важно для успешного извлечения РНК спермы)

• Свежие образцы спермы идеальны. Если необходимо хранение, немедленно поместите образец в раствор для консервации РНК (например, РНКлаты), инкубировать при 4°C в течение ночи, а затем перенести в -80°C для длительного хранения.. Избегайте прямого замораживания, поскольку кристаллы льда могут нарушить структуру клетки и разрушить РНК.
• Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания.

2.2 Подготовка ключевых реагентов

• Используйте специальный набор для экстракции РНК спермы, коммерчески оптимизированный для спермы или сложных образцов..
• Обеззараживание РНКазы: Опрыскайте рабочие поверхности и пипетки средством RNase Zap., и носить перчатки и маску. Используйте наконечники и центрифужные пробирки, не содержащие РНКазы..
• Восстановитель (DTT): Мембраны сперматозоидов богаты дисульфидными связями.. DTT (Дитиотреитол) имеет решающее значение для лизиса. Убедитесь, что в комплект входит DTT, или подготовьте его самостоятельно. (обычная рабочая концентрация: 100 мм).
• ДНКаза I: Сперматозоиды богаты ДНК. Этап расщепления ДНКазой необходим для удаления загрязнения геномной ДНК..

2.3 Предварительное охлаждение:

• Предварительно охладите центрифуги и роторы, чтобы 4 ℃

3. Стандартная рабочая процедура (Использование универсального набора для экстракции тотальной РНК компании Shanghai Lingjun Biotechnology в качестве примера)

Внимательно следуйте подробным инструкциям руководства при использовании инструментов для ручной или автоматической экстракции нуклеиновых кислот..

4. Оценка качества

После извлечения, важно оценить качество РНК:

4.1 Концентрация и чистота:

Высококачественная РНК должна иметь соотношение А260/А280 между 1.8 и 2.1, и соотношение A260/A230 больше, чем 2.0.

4.2 Честность (Самый критический):

Биоанализатор Agilent или TapeStation: Это золотой стандарт. Из-за отсутствия пиков 18S и 28S рибосомальной РНК, электрофоретический профиль тотальной РНК сперматозоидов отличается от профиля типичной клеточной РНК.

Высококачественная РНК спермы должна иметь отчетливые пики около ~2000 нт и ~100 нт. (представляющие мРНК и малую РНК, соответственно), со стабильной базой. Индекс деградации (ДВ200) должно быть выше 60% (чем выше, тем лучше).

Традиционный электрофорез в агарозном геле: Может наблюдаться мазок, но он не может точно оценить целостность или обнаружить малые РНК.

5. Ключевые соображения и устранение неполадок

5.1 Низкая доходность:

Причины: Неполный лизис, недостаточная концентрация ДТТ/время инкубации, низкое начальное количество клеток, неадекватное связывание или элюирование магнитных гранул.

Решения: Обеспечьте тщательное встряхивание во время лизиса.; увеличить концентрацию ДТТ или время лизиса; увеличить начальный объем выборки; оптимизировать объем и температуру элюирующего буфера.

5.2 Загрязнение гДНК:

Причины: Неактивное или неполное переваривание ДНКазой I.

Решения: Убедитесь, что ДНКаза I свежа и эффективна; включить дополнительный шаг для удаления ДНКазы (например, добавление ЭДТА и инактивация нагреванием).

5.3 Деградация РНК:

Причины: Загрязнение РНКазой, слишком высокие рабочие температуры, повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания образцов.

Решения: Строго соблюдайте протоколы обеззараживания РНКазой.; выполнить все действия на льду; используйте свежие или правильно консервированные образцы.

5.4 Низкое соотношение A260/A230:

Причины: Остаточные ионы солей или органические растворители (например, этанол).

Решения: Увеличьте время высыхания, 1-2 минут с открытой трубкой после мытья; обеспечить полное удаление окончательного промывочного раствора.

Краткое содержание

Ключом к успешному выделению высококачественной РНК сперматозоидов является эффективный лизис DTT., тщательное удаление гДНК, и строгий контроль РНКазы. Следуя инструкциям комплекта и обращая внимание на приведенные выше детали., у вас будут высокие шансы на успех.

Поставщик

Шанхайская биотехнологическая компания Линцзюнь., ОООбыл создан в 2016 который является профессиональным производителем биомагнитных материалов и реагентов для экстракции нуклеиновых кислот..

Мы имеем богатый опыт в экстракции и очистке нуклеиновых кислот., очистка белка, разделение клеток, хемилюминесценция, и другие технические области.

Наша продукция широко используется во многих областях., например, медицинское тестирование, генетическое тестирование, университетские исследования, генетическое разведение, и так далее. Мы не только поставляем продукцию, но и можем взять на себя OEM, ОДМ, и другие потребности. Если у вас есть соответствующая потребность, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам .