शुक्राणु कोशिकाओं आरएनए को कुशलतापूर्वक कैसे निकालें?

का उपयोग करते हुए यूनिवर्सल टोटल आरएनए एक्सट्रैक्शन किट शुक्राणु कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाला आरएनए निकालना एक समस्या है क्योंकि शुक्राणु कोशिकाओं की अनूठी संरचना के कारण इस प्रयोग में परिचालन विवरण पर बहुत ध्यान देने की आवश्यकता होती है। (कठोर कोशिका झिल्ली, न्यूक्लियोप्रोटीन से भरपूर, कम आरएनए सामग्री, और गिरावट के प्रति उच्च संवेदनशीलता), विशेष देखभाल की आवश्यकता है.

1.मूल सिद्धांत:

चुंबकीय मनका विधि सिलिकॉन हाइड्रॉक्सिल समूह के साथ लेपित चुंबकीय माइक्रोस्फीयर पर निर्भर करती है. उच्च-नमक और निम्न-पीएच स्थितियों के तहत, ये मोती विशेष रूप से आरएनए को बांधते हैं. चुंबकीय पृथक्करण के माध्यम से अशुद्धियाँ दूर हो जाती हैं, और शुद्ध आरएनए कम नमक में घुल जाता है, उच्च-पीएच वातावरण.

2. प्रयोग से पहले विशेष तैयारी

2.1 नमूना संग्रह और संरक्षण (सफल शुक्राणु आरएनए निष्कर्षण के लिए महत्वपूर्ण)

• ताजा वीर्य के नमूने आदर्श हैं. यदि भंडारण आवश्यक है, नमूने को तुरंत आरएनए संरक्षण समाधान में रखें (जैसे, आरएनएलेट्स), रात भर 4°C पर इनक्यूबेट करें, और फिर दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80°C पर स्थानांतरित करें. सीधी ठंड से बचें, क्योंकि बर्फ के क्रिस्टल कोशिका संरचना को बाधित कर सकते हैं और आरएनए को ख़राब कर सकते हैं.
• बार-बार जमने-पिघलने के चक्र से बचें.

2.2 मुख्य अभिकर्मक तैयारी

• शुक्राणु या चुनौतीपूर्ण नमूनों के लिए व्यावसायिक रूप से अनुकूलित एक समर्पित शुक्राणु आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें.
• RNase परिशोधन: काम की सतहों और पिपेट पर RNase जैप का छिड़काव करें, और दस्ताने और मास्क पहनें. RNase-मुक्त टिप्स और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें.
• संदर्भ पुस्तकें (डीटीटी): शुक्राणु कोशिका झिल्लियाँ डाइसल्फ़ाइड बंधों से समृद्ध होती हैं. डीटीटी (डिथियोथ्रेइटोल) लसीका के लिए महत्वपूर्ण है. सुनिश्चित करें कि किट में डीटीटी शामिल है या इसे स्वयं तैयार करें (सामान्य कामकाजी एकाग्रता: 100 मिमी).
• DNase I: शुक्राणु कोशिकाएं डीएनए से भरपूर होती हैं. जीनोमिक डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए DNase पाचन चरण आवश्यक है.

2.3 पूर्व ठंडा:

• सेंट्रीफ्यूज और रोटर्स को प्री-कूल करें 4 ℃

3. मानक संचालन प्रक्रिया (एक उदाहरण के रूप में शंघाई लिंगजुन बायोटेक्नोलॉजी के यूनिवर्सल टोटल आरएनए एक्सट्रैक्शन किट का उपयोग करना)

मैन्युअल निष्कर्षण या स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण उपकरणों के लिए मैनुअल के विस्तृत निर्देशों का ध्यानपूर्वक पालन करें.

4. गुणवत्ता मूल्यांकन

निष्कर्षण के बाद, आरएनए की गुणवत्ता का मूल्यांकन करना आवश्यक है:

4.1 एकाग्रता एवं पवित्रता:

उच्च गुणवत्ता वाले RNA का अनुपात A260/A280 के बीच होना चाहिए 1.8 और 2.1, और A260/A230 अनुपात से अधिक है 2.0.

4.2 अखंडता (सर्वाधिक गंभीर):

एजिलेंट बायोएनालाइज़र या टेपस्टेशन: यह स्वर्ण मानक है. 18S और 28S राइबोसोमल RNA शिखरों की अनुपस्थिति के कारण, कुल शुक्राणु आरएनए का इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोफ़ाइल विशिष्ट सेलुलर आरएनए से भिन्न होता है.

उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु आरएनए को ~2000 एनटी और ~100 एनटी के आसपास अलग-अलग चोटियाँ दिखानी चाहिए (एमआरएनए और छोटे आरएनए का प्रतिनिधित्व करना, क्रमश:), एक स्थिर आधार रेखा के साथ. ह्रास सूचकांक (डीवी200) ऊपर होना चाहिए 60% (जितना ऊँचा, उतना ही बेहतर).

पारंपरिक अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन: धब्बा देखा जा सकता है, लेकिन यह अखंडता का सटीक आकलन नहीं कर सकता या छोटे आरएनए का पता नहीं लगा सकता.

5. मुख्य विचार और समस्या निवारण

5.1 कम प्राप्ति:

कारण: अपूर्ण लसीका, अपर्याप्त डीटीटी एकाग्रता/ऊष्मायन समय, कम आरंभिक सेल गिनती, अपर्याप्त चुंबकीय मनका बंधन या निक्षालन.

समाधान: लसीका के दौरान पूरी तरह से भंवर सुनिश्चित करें; डीटीटी एकाग्रता या लसीका समय बढ़ाएँ; प्रारंभिक नमूना मात्रा बढ़ाएँ; रेफरेंस बफर मात्रा और तापमान को अनुकूलित करें.

5.2 जीडीएनए संदूषण:

कारण: निष्क्रिय या अपूर्ण DNase I पाचन.

समाधान: सुनिश्चित करें कि DNase I ताज़ा और प्रभावी है; DNase को हटाने के लिए एक अतिरिक्त चरण शामिल करें (जैसे, EDTA जोड़ना और गर्म करके निष्क्रिय करना).

5.3 आरएनए क्षरण:

कारण: RNase संदूषण, अत्यधिक उच्च परिचालन तापमान, नमूनों का बार-बार जमना-पिघलना चक्र.

समाधान: RNase परिशोधन प्रोटोकॉल का सख्ती से पालन करें; सभी चरण बर्फ पर करें; ताजा या उचित रूप से संरक्षित नमूनों का उपयोग करें.

5.4 निम्न A260/A230 अनुपात:

कारण: अवशिष्ट नमक आयन या कार्बनिक विलायक (जैसे, इथेनॉल).

समाधान: सुखाने का समय बढ़ाएँ 1-2 धोने के बाद ट्यूब को कुछ मिनटों तक खुला रखें; अंतिम धुलाई समाधान का पूर्ण निष्कासन सुनिश्चित करें.

सारांश

उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु आरएनए को सफलतापूर्वक निकालने की कुंजी प्रभावी डीटीटी लसीका में निहित है, संपूर्ण जीडीएनए निष्कासन, और कठोर RNase नियंत्रण. किट निर्देशों का पालन करके और उपरोक्त विवरणों पर ध्यान देकर, आपके पास सफलता की उच्च संभावना होगी.

देने वाला

शंघाई लिंगजुन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेडमें स्थापित किया गया था 2016 जो बायोमैग्नेटिक सामग्रियों और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण अभिकर्मकों का एक पेशेवर निर्माता है.

हमारे पास न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण में समृद्ध अनुभव है, प्रोटीन शुद्धि, कोशिका पृथक्करण, chemiluminescence, और अन्य तकनीकी क्षेत्र.

हमारे उत्पाद कई क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, जैसे चिकित्सा परीक्षण, आनुवंशिक परीक्षण, विश्वविद्यालय अनुसंधान, आनुवंशिक प्रजनन, और इसी तरह. हम न केवल उत्पाद उपलब्ध कराते हैं बल्कि ओईएम का कार्य भी कर सकते हैं, ओडीएम, और अन्य जरूरतें. यदि आपको इससे संबंधित कोई आवश्यकता है, हमसे संपर्क करने के लिए कृपया स्वतंत्र महसूस करें .