정자 세포 RNA를 효율적으로 추출하는 방법?

사용 Universal Total RNA 추출 키트 이 실험은 정자 세포의 독특한 구조로 인해 작업 세부 사항에 큰 관심이 필요하기 때문에 정자 세포에서 고품질 RNA를 추출하는 것이 문제입니다. (단단한 세포막, 핵단백질이 풍부하다, 낮은 RNA 함량, 그리고 분해에 대한 높은 민감성), 특별한 취급이 필요한.

1.핵심원리:

자기 비드 방법은 실리콘 수산기로 코팅된 자기 미소구체에 의존합니다.. 고염 및 저 pH 조건에서, 이 비드는 RNA에 특이적으로 결합합니다.. 자력선별을 통해 불순물을 제거, 순수한 RNA는 저염 용액에서 용출됩니다., 높은 pH 환경.

2. 실험 전 특별 준비사항

2.1 샘플 수집 및 보존 (성공적인 정자 RNA 추출에 중요)

• 신선한 정액 샘플이 이상적입니다.. 보관이 필요한 경우, 즉시 샘플을 RNA 보존 용액에 넣습니다. (예를 들어, RNAlate), 밤새 4°C에서 배양, 그런 다음 장기 보관을 위해 -80°C로 옮깁니다.. 직접 냉동을 피하십시오, 얼음 결정은 세포 구조를 파괴하고 RNA를 분해할 수 있기 때문입니다..
• 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오..

2.2 주요 시약 준비

• 정자 또는 까다로운 샘플에 대해 상업적으로 최적화된 전용 정자 RNA 추출 키트를 사용하세요..
• RNase 오염 제거: RNase Zap으로 작업 표면과 피펫에 스프레이, 그리고 장갑과 마스크를 착용하세요. RNase-free 팁과 원심분리 튜브 사용.
• 환원제 (DTT): 정자 세포막에는 이황화 결합이 풍부합니다.. DTT (디티오트레이톨) 용해에 중요합니다. 키트에 DTT가 포함되어 있는지 확인하거나 직접 준비하세요. (일반적인 작업 농도: 100 mm).
• DNase I: 정자 세포에는 DNA가 풍부합니다.. 게놈 DNA 오염을 제거하려면 DNase 분해 단계가 필수적입니다..

2.3 사전 냉각:

• 원심분리기와 로터를 사전 냉각하여 4 ℃

3. 표준 운영 절차 (Shanghai Lingjun Biotechnology의 Universal Total RNA 추출 키트를 예로 사용)

수동 추출 또는 자동화된 핵산 추출 장비에 대한 설명서의 자세한 지침을 주의 깊게 따르십시오..

4. 품질 평가

추출 후, RNA의 품질을 평가하는 것이 필수적입니다.:

4.1 농도와 순도:

고품질 RNA는 A260/A280 비율을 가져야 합니다. 1.8 그리고 2.1, A260/A230 비율이 다음보다 큼 2.0.

4.2 진실성 (가장 중요함):

애질런트 바이오분석기 또는 TapeStation: 이것이 금본위제이다. 18S 및 28S 리보솜 RNA 피크가 없기 때문에, 전체 정자 RNA의 전기영동 프로파일은 일반적인 세포 RNA의 전기영동 프로파일과 다릅니다..

고품질 정자 RNA는 ~2000nt와 ~100nt 정도의 뚜렷한 피크를 보여야 합니다. (mRNA와 작은 RNA를 나타내는, 각기), 안정적인 기준으로. 저하 지수 (DV200) 위에 있어야 한다 60% (더 높을수록, 더 나은).

기존의 아가로스 겔 전기영동: 얼룩이 관찰될 수 있음, 그러나 무결성을 정확하게 평가하거나 작은 RNA를 감지할 수는 없습니다..

5. 주요 고려 사항 및 문제 해결

5.1 낮은 수율:

원인: 불완전한 용해, 불충분한 DTT 농도/인큐베이션 시간, 낮은 시작 세포 수, 부적절한 자기 비드 결합 또는 용출.

솔루션: 용해 중 철저한 vortexing을 보장합니다.; DTT 농도 또는 용해 시간 증가; 시작 샘플량을 늘립니다.; 용출 완충액 용량 및 온도 최적화.

5.2 gDNA 오염:

원인: 비활성 또는 불완전한 DNase I 소화.

솔루션: DNase I이 신선하고 효과적인지 확인하세요.; DNase를 제거하는 추가 단계를 포함합니다. (예를 들어, EDTA를 첨가하고 가열하여 불활성화하는 것).

5.3 RNA 분해:

원인: RNase 오염, 지나치게 높은 작동 온도, 샘플의 반복적인 동결-해동 주기.

솔루션: RNase 오염 제거 프로토콜을 엄격히 준수합니다.; 얼음 위에서 모든 단계를 수행; 신선하거나 적절하게 보존된 샘플을 사용하십시오..

5.4 낮은 A260/A230 비율:

원인: 잔류 염 이온 또는 유기 용매 (예를 들어, 에탄올).

솔루션: 건조 시간을 연장하세요. 1-2 세척 후 튜브를 연 채로 몇 분; 최종 세척액이 완전히 제거되도록 보장.

요약

고품질 정자 RNA를 성공적으로 추출하는 열쇠는 효과적인 DTT 용해에 있습니다., 철저한 gDNA 제거, 엄격한 RNase 제어. 키트 지침을 따르고 위의 세부 사항에 주의를 기울임으로써, 당신은 성공할 확률이 높을 것이다.

공급자

상하이 링쥔 생명공학 유한회사, 주식회사에 설립되었습니다 2016 생체자성재료 및 핵산추출시약 전문제조업체입니다..

핵산 추출 및 정제 분야에서 풍부한 경험을 보유하고 있습니다., 단백질 정제, 세포 분리, 화학발광, 및 기타 기술 분야.

우리의 제품은 많은 분야에서 널리 사용됩니다., 의료 테스트와 같은, 유전자 검사, 대학 연구, 유전자 육종, 등. 우리는 제품을 제공할 뿐만 아니라 OEM도 수행할 수 있습니다., ODM, 그리고 다른 필요. 관련된 필요사항이 있는 경우, 저희에게 연락하게 자유롭게 느끼십시오 .