Sådan ekstraheres sædcellers RNA effektivt?

Bruger Universal Total RNA Extraction Kit at udvinde RNA af høj kvalitet fra sædceller er et problem, fordi dette eksperiment kræver stor opmærksomhed på operationelle detaljer på grund af sædcellernes unikke struktur (hård cellemembran, rig på nukleoproteiner, lavt RNA-indhold, og høj modtagelighed for nedbrydning), kræver særlig håndtering.

1.Kerneprincip:

Den magnetiske perlemetode er afhængig af magnetiske mikrosfærer belagt med en siliciumhydroxylgruppe. Under forhold med højt salt og lavt pH, disse perler binder specifikt RNA. Urenheder fjernes gennem magnetisk adskillelse, og rent RNA elueres i et lavt saltindhold, miljø med høj pH.

2. Særlige forberedelser før forsøget

2.1 Prøveindsamling og konservering (Kritisk for vellykket sperm-RNA-ekstraktion)

• Friske sædprøver er ideelle. Hvis opbevaring er nødvendig, anbring straks prøven i RNA-konserveringsopløsning (f.eks., RNAlater), inkuberes ved 4°C natten over, og overfør derefter til -80°C til langtidsopbevaring. Undgå direkte frysning, da iskrystaller kan forstyrre cellestrukturen og nedbryde RNA.
• Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser.

2.2 Forberedelse af nøglereagens

• Brug et dedikeret sæd-RNA-ekstraktionssæt, der er kommercielt optimeret til sædceller eller udfordrende prøver.
• RNase dekontaminering: Spray arbejdsflader og pipetter med RNase Zap, og bære handsker og maske. Brug RNase-fri spidser og centrifugerør.
• Reduktionsmiddel (DTT): Sædcellemembraner er rige på disulfidbindinger. DTT (Dithiothreitol) er kritisk for lysis. Sørg for, at sættet indeholder DTT, eller klargør det selv (almindelig arbejdskoncentration: 100 mM).
• DNase I: Sædceller er rige på DNA. Et DNase-fordøjelsestrin er afgørende for at fjerne genomisk DNA-kontamination.

2.3 Forkøling:

• Forafkøle centrifuger og rotorer til 4 ℃

3. Standard betjeningsprocedure (Brug af Shanghai Lingjun Biotechnologys Universal Total RNA Extraction Kit som et eksempel)

Følg manualens detaljerede instruktioner omhyggeligt for manuel ekstraktion eller automatiserede nukleinsyreekstraktionsinstrumenter.

4. Kvalitetsvurdering

Efter ekstraktion, det er vigtigt at evaluere kvaliteten af ​​RNA'et:

4.1 Koncentration og renhed:

RNA af høj kvalitet bør have et A260/A280-forhold mellem 1.8 og 2.1, og et A260/A230-forhold større end 2.0.

4.2 Integritet (Mest Kritisk):

Agilent Bioanalyzer eller TapeStation: Dette er guldstandarden. På grund af fraværet af 18S og 28S ribosomale RNA-toppe, den elektroforetiske profil af totalt sæd-RNA adskiller sig fra den for typisk cellulært RNA.

Sæd-RNA af høj kvalitet bør vise tydelige toppe omkring ~2000 nt og ~100 nt (repræsenterer mRNA og lille RNA, henholdsvis), med en stabil baseline. Nedbrydningsindekset (DV200) skal være over 60% (jo højere, jo bedre).

Konventionel agarosegelelektroforese: En udstrygning kan observeres, men det kan ikke nøjagtigt vurdere integritet eller detektere små RNA'er.

5. Nøgleovervejelser og fejlfinding

5.1 Lavt udbytte:

Årsager: Ufuldstændig lysering, utilstrækkelig DTT-koncentration/inkubationstid, lavt startcelleantal, utilstrækkelig magnetisk perlebinding eller eluering.

Løsninger: Sørg for grundig vortexing under lysis; øge DTT-koncentrationen eller lyseringstiden; øge startprøvevolumenet; optimere elueringsbuffervolumen og temperatur.

5.2 gDNA kontaminering:

Årsager: Inaktiv eller ufuldstændig DNase I-fordøjelse.

Løsninger: Sørg for, at DNase I er frisk og effektiv; inkludere et ekstra trin for at fjerne DNase (f.eks., tilføjelse af EDTA og inaktivering ved opvarmning).

5.3 RNA-nedbrydning:

Årsager: RNase-kontamination, for høje driftstemperaturer, gentagne fryse-tø-cyklusser af prøver.

Løsninger: Overhold strengt til RNase-dekontamineringsprotokoller; udføre alle trin på is; brug friske eller korrekt konserverede prøver.

5.4 Lavt A260/A230-forhold:

Årsager: Resterende saltioner eller organiske opløsningsmidler (f.eks., ethanol).

Løsninger: Forlæng tørretiden med 1-2 minutter med røret åbent efter vask; sikre fuldstændig fjernelse af den endelige vaskeopløsning.

Oversigt

Nøglen til succesfuld udvinding af sæd-RNA af høj kvalitet ligger i effektiv DTT-lyse, grundig gDNA fjernelse, og stringent RNase-kontrol. Ved at følge sættets instruktioner og være opmærksom på ovenstående detaljer, du vil have en høj chance for succes.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.blev etableret i 2016 som er en professionel producent af biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraktionsreagenser.

Vi har stor erfaring med udvinding og oprensning af nukleinsyre, proteinoprensning, celleadskillelse, kemiluminescens, og andre tekniske områder.

Vores produkter er meget udbredt inden for mange områder, såsom medicinsk test, genetisk testning, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke kun produkter, men kan også påtage os OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relateret behov, er du velkommen til at kontakte os .