Aplicação de microesferas de poliestireno em PCR digital

Como a terceira geração de PCR, PCR digital tem as vantagens da quantificação absoluta, baixa exigência de amostra, alta sensibilidade, e tolerância a inibidores, e é amplamente utilizado na detecção de mutação genética, variação do número de cópias, microorganismos patogênicos, e culturas geneticamente modificadas. O PCR digital no mercado geralmente é o Droplet Digital PCR (ddPCR) representado pela Bio-Rad e Chip Digital PCR (CDPCR) representado por Thermo Fisher; ou seja, A Bio-Rad divide o sistema de amplificação em unidades nano ou mícron por tecnologia microfluídica na forma de água em óleo, enquanto Thermo Fisher divide o sistema de amplificação em unidades nano ou mícron por tecnologia microfluídica, e Thermo Fisher divide o sistema de amplificação em unidades nano ou mícron por tecnologia microfluídica. unidades micrométricas e o Thermo Fisher separa o sistema de amplificação em unidades nano/micrométricas por corte físico. Essas duas rotas tecnológicas são mais amplamente utilizadas com microfluídica de gotículas da Bio-Rad, que oferece vantagens significativas de miniaturização, regionalização, e paralelização devido à sua capacidade de encapsular microesferas, células, e outros reagentes em microrreatores de nanolitros ou picolitros.

Exossomos são vesículas de membrana submícron (30-200 nm) secretado pelas células e contém informações importantes, como proteínas, RNA minúsculo, e ADN, que estão intimamente relacionados com biópsias líquidas clínicas para diagnóstico de doenças e testes prognósticos. No entanto, seu pequeno tamanho representa um grande desafio para isolar exossomos de fluidos corporais complexos com alto rendimento e pureza. Fixando Zhou et al. propuseram uma estrutura de canal de onda reversa usando um fluido viscoelástico com adição de polímeros biocompatíveis [2] para focagem inercial elástica e classificação de partículas submicrométricas e exossomos. A estrutura repetitiva do canal de onda produz um fluxo secundário Dean reverso periódico de microfluido que promove o foco da microesfera em comparação com um canal direto convencional. Usando quatro tamanhos diferentes de esferas submicrométricas fluorescentes (1 µm, 500 nm, 300, e 100 nm) estudar o comportamento de focagem sob diferentes condições, eles conseguiram simples, alto rendimento, classificação sem rótulo de exossomos com pureza superior a 92% e recuperação superior a 81%. Esta técnica desenvolvida de classificação de exossomos inerciais elásticos pode fornecer uma plataforma promissora para vários estudos biológicos e aplicações farmacêuticas relacionadas a exossomos.

Apesar do grande potencial destas aplicações, o encapsulamento de microesferas/células é completamente aleatório, e limitado pela distribuição de Poisson. A probabilidade de uma gota encapsular uma única microesfera é teoricamente não superior a 37%, desperdiçando um grande número de microesferas e partições de gotículas, resultando em baixo rendimento de detecção. Para melhorar a utilização de microesferas ou células raras, métodos comumente usados ​​normalmente usam uma média teórica (λT) < 0.1 de microesferas/células por gota para determinar a concentração de microesferas aplicadas, o que resulta em uma taxa de encapsulamento muito baixa de microesferas individuais, normalmente abaixo 10%. Beneficiando-se do número infinito de gotículas no sistema de gotículas, a distribuição de Poisson tem menos impacto no consumo de amostra e no tempo de ensaio quando o número de microesferas/células a serem contadas é pequeno.

O encapsulamento de gotículas de células individuais ou microesferas de poliestireno tem uma ampla gama de aplicações em áreas como ensaios digitais, sequenciamento unicelular, e triagem de drogas. No entanto, o encapsulamento de microesferas é completamente aleatório pelas restrições de distribuição de Poisson, e a probabilidade teórica de encapsulamento de microesferas únicas é geralmente apenas cerca de 10%. Em detecção digitalizada ultra-multiplexada ou outras aplicações que exigem a medição de um grande número de microesferas, o número de partições que precisam ser contadas é extremamente alto, levando a um grande aumento no número de contagens de gotículas inválidas e redundância de dados de detecção. Por esta razão, Xiaoyu Yue projetou uma gota de arranjo ordenada por contas (BOAD) sistema como forma de quebrar as limitações da distribuição de Poisson [1].

O sistema BOAD combina de forma inteligente o fluxo da bainha, Vórtice Dean, e canal de fluxo de compressão para realizar o primeiro arranjo ordenado de microesferas e permite o arranjo ordenado mais rápido de microesferas na estrutura mais curta, com eficiência de encapsulamento de grânulo único até cerca de 86%. Outras aplicações para encapsular microesferas codificadas e microesferas de poliestireno magnético direcionadas a IL-10 demonstraram totalmente o potencial da detecção digital ultra-multiplexada baseada em microesferas. Como resultado, o sistema BOAD é muito promissor para muitas aplicações que exigem altas taxas de encapsulamento de partícula única em compartimentos limitados, como bioensaios digitais ultra-multiplexados, análise unicelular, triagem de drogas, e detecção de exossomo único.

Em todas as aplicações, encapsulamento de partículas baseado em gotículas (células e microesferas) é uma plataforma ideal para análise unicelular de reprogramação celular, descoberta de drogas, e detecção de secreção devido aos seus diâmetros de reator uniformemente pequenos, fenômenos únicos de fluxo em microescala, e número ilimitado de unidades de isolamento, e também permite a detecção digital ultrassensível baseada em esferas de proteínas de baixa abundância, exossomos, e outras biomoléculas.

Referência：

[1] Sim, X., Presa, X., Sol, T., Fazer, J., Kuang, X., Guo, Q., Wang, E., Gu, H. e Xu, H. 2022. Rompendo a Distribuição de Poisson: Um sistema microfluídico de gotículas compacto e de alta eficiência para encapsulamento de esfera única e detecção digital de imunoensaio. Biossensores e Bioeletrônica. 211, (Setembro. 2022), 114384. DOI:https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114384.

[2] Zhou, E., Mãe, Z., Tayebi, M. e Ai, S. 2019. Focagem de partículas submicrométricas e classificação de exossomos por estruturas de microcanais ondulados em fluidos viscoelásticos. Química Analítica. 91, 7 (abril. 2019), 4577–4584. DOI:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b05749.

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