Aplicación de microesferas de poliestireno en PCR digital.

Como tercera generación de PCR, La PCR digital tiene las ventajas de la cuantificación absoluta, bajo requisito de muestra, alta sensibilidad, y tolerancia a inhibidores, y es ampliamente utilizado en la detección de mutaciones genéticas., variación del número de copias, microorganismos patógenos, y cultivos transgénicos. La PCR digital del mercado generalmente es Droplet Digital PCR (ddPCR) representado por Bio-Rad y Chip Digital PCR (cdPCR) representado por Thermo Fisher; es decir., Bio-Rad divide el sistema de amplificación en unidades de nano o micras mediante tecnología de microfluidos en forma de agua en aceite, mientras que Thermo Fisher divide el sistema de amplificación en unidades de nano o micras mediante tecnología de microfluidos., y Thermo Fisher divide el sistema de amplificación en unidades de nano o micras mediante tecnología de microfluidos.. unidades micrométricas y Thermo Fisher separa el sistema de amplificación en unidades nano/micrómetro mediante corte físico. Estas dos rutas tecnológicas son las más utilizadas con los microfluidos de gotas de Bio-Rad., que ofrece importantes ventajas de miniaturización, regionalización, y paralelización debido a su capacidad para encapsular microesferas, células, y otros reactivos en microrreactores de nanolitros o picolitros.

Los exosomas son vesículas de membrana submicrónicas. (30-200 Nuevo Méjico) Secretada por las células y contiene información importante como proteínas., ARN diminuto, y ADN, que están estrechamente relacionados con las biopsias líquidas clínicas para el diagnóstico de enfermedades y pruebas de pronóstico.. Sin embargo, su pequeño tamaño plantea un gran desafío para aislar exosomas de fluidos corporales complejos con alto rendimiento y pureza. Fijando a Zhou et al.. propuso una estructura de canal de onda inversa utilizando un fluido viscoelástico con la adición de polímeros biocompatibles [2] para el enfoque inercial elástico y la clasificación de partículas submicrónicas y exosomas. La estructura del canal de onda repetitiva produce un flujo secundario de microfluido Dean inverso periódico que promueve el enfoque de las microesferas en comparación con un canal directo convencional.. Usando cuatro tamaños diferentes de esferas submicrónicas fluorescentes (1 µm, 500 Nuevo Méjico, 300, y 100 Nuevo Méjico) estudiar el comportamiento de enfoque en diferentes condiciones, lo lograron simple, alto rendimiento, clasificación sin etiquetas de exosomas con una pureza superior a 92% y recuperación superior a 81%. Esta técnica de clasificación de exosomas inercial elástica desarrollada puede proporcionar una plataforma prometedora para diversos estudios biológicos y aplicaciones farmacéuticas relacionados con los exosomas..

A pesar del gran potencial de estas aplicaciones, la encapsulación de microesferas/células es completamente aleatoria, y restringido por la distribución de Poisson. La probabilidad de que una gota encapsule una sola microesfera no es teóricamente mayor que 37%, desperdiciar una gran cantidad de microesferas y particiones de gotas, lo que da como resultado un bajo rendimiento de detección. Para mejorar la utilización de microesferas o células raras., Los métodos más utilizados suelen utilizar una media teórica. (λT) < 0.1 de microesferas/células por gota para determinar la concentración de microesferas aplicadas, lo que da como resultado una tasa de encapsulación muy baja de microesferas individuales, normalmente debajo 10%. Beneficiándose del número infinito de gotas en el sistema de gotas, la distribución de Poisson tiene menos impacto en el consumo de muestras y el tiempo de ensayo cuando el número de microesferas/células que se van a contar es pequeño.

La encapsulación de gotitas de células individuales o microesferas de poliestireno tiene una amplia gama de aplicaciones en áreas como los ensayos digitales., secuenciación unicelular, y detección de drogas. Sin embargo, la encapsulación de microesferas es completamente aleatoria según las restricciones de distribución de Poisson, y la probabilidad teórica de encapsulación de una sola microesfera suele ser sólo de aproximadamente 10%. En detección digitalizada de multiplexación ultra alta u otras aplicaciones que requieren la medición de una gran cantidad de microesferas, el número de particiones que deben contarse es extremadamente alto, lo que lleva a un gran aumento en el número de recuentos de gotas no válidas y a la redundancia de los datos de detección. Por esta razón, Xiaoyu Yue diseñó una gota de disposición ordenada con cuentas (BOAD) sistema como una forma de romper las limitaciones de la distribución de Poisson [1].

El sistema BOAD combina inteligentemente el flujo de vaina, vórtice decano, y canal de flujo de compresión para realizar la primera disposición ordenada de microesferas y permite la disposición ordenada más rápida de microesferas en la estructura más corta, con una eficiencia de encapsulación de una sola perla de hasta aproximadamente 86%. Otras aplicaciones para encapsular microesferas codificadas y microesferas de poliestireno magnéticas dirigidas a IL-10 han demostrado plenamente el potencial de la detección digital ultraaltamente multiplexada basada en microesferas.. Como resultado, El sistema BOAD es muy prometedor para muchas aplicaciones que requieren altas tasas de encapsulación de partículas individuales dentro de compartimentos limitados., como bioensayos digitales de multiplexación ultra alta, análisis unicelular, detección de drogas, y detección de un solo exosoma.

En todas las aplicaciones, encapsulación de partículas a base de gotas (células y microesferas) es una plataforma ideal para el análisis unicelular de la reprogramación celular, descubrimiento de drogas, y detección de secreciones gracias al diámetro uniformemente pequeño del reactor, fenómenos de flujo a microescala únicos, y número ilimitado de unidades de aislamiento, y también permite la detección digital ultrasensible basada en perlas de proteínas de baja abundancia, exosomas, y otras biomoléculas.

Referencia：

[1] yue, INCÓGNITA., Colmillo, INCÓGNITA., Sol, T., Hacer, J., kuang, INCÓGNITA., guo, P., Wang, y., Gu, h. y Xu, h. 2022. Rompiendo la distribución de Poisson: Un sistema de microfluidos de gotas compacto de alta eficiencia para encapsulación de una sola perla y detección de inmunoensayo digital. Biosensores y Bioelectrónica. 211, (Sep. 2022), 114384. DOI:https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114384.

[2] zhou, y., Mamá, Z., tayebi, METRO. y ai, Y. 2019. Enfoque de partículas submicrónicas y clasificación de exosomas mediante estructuras de microcanales ondulados dentro de fluidos viscoelásticos. Química analítica. 91, 7 (Abr. 2019), 4577–4584. DOI:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b05749.

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