Anwendung von Polystyrol-Mikrosphären in der digitalen PCR

Als dritte Generation der PCR, Die digitale PCR bietet die Vorteile der absoluten Quantifizierung, geringer Probenbedarf, hohe empfindlichkeit, und Toleranz gegenüber Inhibitoren, und wird häufig zum Nachweis von Genmutationen eingesetzt, Variation der Exemplarnummer, pathogene Mikroorganismen, und gentechnisch veränderte Pflanzen. Die auf dem Markt erhältliche digitale PCR ist im Allgemeinen die Droplet Digital PCR (ddPCR) vertreten durch Bio-Rad und Chip Digital PCR (cdPCR) vertreten durch Thermo Fisher; d.h., Bio-Rad unterteilt das Verstärkungssystem mithilfe der Mikrofluidik-Technologie in Form von Wasser-in-Öl in Nano- oder Mikrometereinheiten, während Thermo Fisher das Verstärkungssystem durch Mikrofluidik-Technologie in Nano- oder Mikrometer-Einheiten unterteilt, und Thermo Fisher unterteilt das Verstärkungssystem durch Mikrofluidiktechnologie in Nano- oder Mikrometereinheiten. Mikrometer-Einheiten und Thermo Fisher trennt das Verstärkungssystem durch physikalisches Schneiden in Nano-/Mikrometer-Einheiten. Diese beiden Technologiewege werden am häufigsten bei der Tröpfchenmikrofluidik von Bio-Rad eingesetzt, was erhebliche Vorteile der Miniaturisierung bietet, Regionalisierung, und Parallelisierung aufgrund seiner Fähigkeit, Mikrokügelchen einzukapseln, Zellen, und andere Reagenzien in Nanoliter- oder Pikoliter-Mikroreaktoren.

Exosomen sind Membranvesikel im Submikronbereich (30-200 nm) werden von Zellen abgesondert und enthalten wichtige Informationen wie Proteine, winzige RNA, und DNA, die in engem Zusammenhang mit klinischen Flüssigbiopsien zur Krankheitsdiagnose und Prognosetests stehen. Jedoch, Ihre geringe Größe stellt eine große Herausforderung für die Isolierung von Exosomen aus komplexen Körperflüssigkeiten mit hohem Durchsatz und hoher Reinheit dar. Pinning Zhou et al. schlugen eine Umkehrwellenkanalstruktur unter Verwendung einer viskoelastischen Flüssigkeit unter Zusatz biokompatibler Polymere vor [2] zur elastischen Trägheitsfokussierung und Sortierung von Submikronpartikeln und Exosomen. Die sich wiederholende Wellenkanalstruktur erzeugt einen periodischen, umgekehrten Dean-Sekundärfluss von Mikroflüssigkeit, der die Fokussierung der Mikrokügelchen im Vergleich zu einem herkömmlichen Kanal mit geradem Durchgang fördert. Verwendung von vier verschiedenen Größen fluoreszierender Submikron-Kugeln (1 µm, 500 nm, 300, Und 100 nm) das Fokussierungsverhalten unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, Sie haben es einfach erreicht, hoher Durchsatz, Markierungsfreie Sortierung von Exosomen mit einer Reinheit höher als 92% und Erholung höher als 81%. Diese entwickelte elastische Trägheits-Exosomensortiertechnik könnte eine vielversprechende Plattform für verschiedene Exosomen-bezogene biologische Studien und pharmazeutische Anwendungen bieten.

Trotz des großen Potenzials dieser Anwendungen, Die Einkapselung von Mikrosphären/Zellen erfolgt vollständig randomisiert, und durch die Poisson-Verteilung eingeschränkt. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Tröpfchen eine einzelne Mikrokugel einkapselt, beträgt theoretisch nicht mehr als 37%, Es wird eine große Anzahl an Mikrokügelchen und Tröpfchenpartitionen verschwendet, was zu einem geringen Nachweisdurchsatz führt. Zur Verbesserung der Nutzung von Mikrosphären oder seltenen Zellen, Häufig verwendete Methoden verwenden typischerweise einen theoretischen Mittelwert (λT) < 0.1 Anzahl der Mikrokügelchen/Zellen pro Tropfen, um die Konzentration der aufgetragenen Mikrokügelchen zu bestimmen, was zu einer sehr geringen Einkapselungsrate einzelner Mikrokügelchen führt, normalerweise unten 10%. Profitieren Sie von der unendlichen Anzahl an Tropfen im Tropfensystem, Die Poisson-Verteilung hat weniger Einfluss auf den Probenverbrauch und die Testzeit, wenn die Anzahl der zu zählenden Mikrokügelchen/Zellen gering ist.

Die Tröpfchenverkapselung einzelner Zellen oder Polystyrol-Mikrokügelchen hat ein breites Anwendungsspektrum in Bereichen wie digitalen Assays, Einzelzellsequenzierung, und Drogenscreening. Jedoch, Die Einkapselung von Mikrokügelchen ist durch Poisson-Verteilungsbeschränkungen vollständig randomisiert, und die theoretische Wahrscheinlichkeit der Einkapselung einzelner Mikrokügelchen beträgt normalerweise nur etwa 100 % 10%. Bei der ultrahochmultiplexten digitalisierten Detektion oder anderen Anwendungen, die die Messung einer großen Anzahl von Mikrokügelchen erfordern, Die Anzahl der zu zählenden Partitionen ist extrem hoch, Dies führt zu einem starken Anstieg der Anzahl ungültiger Tröpfchenzählungen und einer Redundanz der Erkennungsdaten. Aus diesem Grund, Xiaoyu Yue entwarf ein Bead Ordered Arrangement Droplet (BOAD) System als eine Möglichkeit, die Beschränkungen der Poisson-Verteilung zu durchbrechen [1].

The BOAD system cleverly combines sheath flow, Dean vortex, and compression flow channel to realize the first-ever ordered arrangement of microspheres and enables the fastest ordered arrangement of microspheres in the shortest structure, with single-bead encapsulation efficiency up to about 86%. Further applications to encapsulate coded microspheres and IL-10-targeted magnetic polystyrene microspheres have fully demonstrated the potential of microsphere-based ultra-high-multiplexed digital detection. As a result, the BOAD system is very promising for many applications that require high single-particle encapsulation rates within limited compartments, such as ultra-high-multiplexed digital bioassays, single-cell analysis, drug screening, and single exosome detection.

In all applications, droplet-based encapsulation of particles (cells and microspheres) is an ideal platform for single-cell analysis of cellular reprogramming, drug discovery, and secretion detection due to its uniformly small reactor diameters, unique microscale flow phenomena, and unlimited number of isolation units, and also allows for bead-based ultrasensitive digital detection of low-abundance proteins, exosomes, and other biomolecules.

Referenz：

[1] Yue, X., Fang, X., Sun, T., Yi, J., Kuang, X., Guo, Q., Wang, Y., Gu, H. and Xu, H. 2022. Breaking through the Poisson Distribution: A compact high-efficiency droplet microfluidic system for single-bead encapsulation and digital immunoassay detection. Biosensors and Bioelectronics. 211, (Sep. 2022), 114384. DOI:https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114384.

[2] Zhou, Y., Ma, Z., Tayebi, M. and Ai, Y. 2019. Submicron Particle Focusing and Exosome Sorting by Wavy Microchannel Structures within Viscoelastic Fluids. Analytical Chemistry. 91, 7 (Apr. 2019), 4577–4584. DOI:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b05749.

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