Applicazione di microsfere di polistirene nella PCR digitale

Come la terza generazione di PCR, La PCR digitale presenta i vantaggi della quantificazione assoluta, basso fabbisogno di campione, alta sensibilità, e tolleranza agli inibitori, ed è ampiamente utilizzato nel rilevamento della mutazione genetica, variazione del numero di copie, microrganismi patogeni, e colture geneticamente modificate. La PCR digitale sul mercato è generalmente Droplet Digital PCR (ddPCR) rappresentato da Bio-Rad e Chip Digital PCR (cdPCR) rappresentata da Thermo Fisher; i.e., Bio-Rad divide il sistema di amplificazione in unità nano o micron mediante tecnologia microfluidica sotto forma di acqua in olio, mentre Thermo Fisher divide il sistema di amplificazione in unità nano o micron mediante tecnologia microfluidica, e Thermo Fisher divide il sistema di amplificazione in unità nano o micron mediante tecnologia microfluidica. unità micrometriche e Thermo Fisher separa il sistema di amplificazione in unità nano/micrometriche mediante taglio fisico. Questi due percorsi tecnologici sono più ampiamente utilizzati con la microfluidica delle goccioline Bio-Rad, che offre vantaggi significativi della miniaturizzazione, regionalizzazione, e parallelizzazione grazie alla sua capacità di incapsulare microsfere, cellule, e altri reagenti in microreattori nanolitri o picolitri.

Gli esosomi sono vescicole di membrana sub-micron (30-200 nm) secreti dalle cellule e contengono informazioni importanti come le proteine, minuscolo RNA, e DNA, che sono strettamente correlati alle biopsie liquide cliniche per la diagnosi della malattia e i test prognostici. Tuttavia, le loro piccole dimensioni rappresentano una grande sfida per isolare gli esosomi da fluidi corporei complessi con elevata produttività e purezza. Appuntare Zhou et al. ha proposto una struttura a canale d'onda inversa utilizzando un fluido viscoelastico con l'aggiunta di polimeri biocompatibili [2] per la focalizzazione inerziale elastica e lo smistamento di particelle submicroniche ed esosomi. La struttura del canale d'onda ripetitivo produce un flusso secondario Dean inverso periodico di microfluido che promuove la focalizzazione della microsfera rispetto a un canale diretto convenzionale. Utilizzando quattro diverse dimensioni di sfere fluorescenti submicroniche (1 µm, 500 nm, 300, E 100 nm) studiare il comportamento della messa a fuoco in diverse condizioni, hanno ottenuto risultati semplici, rendimento elevato, ordinamento senza etichetta di esosomi con purezza superiore a 92% e recupero superiore a 81%. Questa tecnica di selezione elastica inerziale degli esosomi può fornire una piattaforma promettente per vari studi biologici e applicazioni farmaceutiche relativi agli esosomi.

Nonostante il grande potenziale di queste applicazioni, l'incapsulamento delle microsfere/cellule è completamente randomizzato, e vincolato dalla distribuzione di Poisson. La probabilità che una gocciolina incapsula una singola microsfera teoricamente non è superiore a 37%, sprecare un gran numero di microsfere e partizioni di goccioline con conseguente bassa produttività di rilevamento. Per migliorare l'utilizzo di microsfere o cellule rare, i metodi comunemente utilizzati utilizzano in genere una media teorica (λT) < 0.1 di microsfere/cellule per gocciolina per determinare la concentrazione di microsfere applicate, il che si traduce in un tasso di incapsulamento molto basso delle singole microsfere, tipicamente di seguito 10%. Beneficiando del numero infinito di goccioline nel sistema droplet, la distribuzione di Poisson ha un impatto minore sul consumo del campione e sul tempo di analisi quando il numero di microsfere/cellule da contare è piccolo.

L'incapsulamento di goccioline di singole cellule o microsfere di polistirene ha un'ampia gamma di applicazioni in settori come i test digitali, sequenziamento di singole cellule, e screening farmacologico. Tuttavia, l'incapsulamento delle microsfere è completamente randomizzato dai vincoli di distribuzione di Poisson, e la probabilità teorica dell'incapsulamento di una singola microsfera è solitamente solo approssimativa 10%. Nel rilevamento digitalizzato ad altissima multiplexing o in altre applicazioni che richiedono la misurazione di un gran numero di microsfere, il numero di partizioni da contare è estremamente elevato, portando a un forte aumento del numero di conteggi di goccioline non valide e alla ridondanza dei dati di rilevamento. Per questo motivo, Xiaoyu Yue ha progettato una goccia di disposizione ordinata di perline (BOAD) sistema come un modo per rompere i limiti della distribuzione di Poisson [1].

Il sistema BOAD combina abilmente il flusso della guaina, Vortice di Dean, e canale di flusso di compressione per realizzare la prima disposizione ordinata di microsfere e consente la disposizione ordinata più rapida delle microsfere nella struttura più breve, con efficienza di incapsulamento a cordone singolo fino a circa 86%. Ulteriori applicazioni per incapsulare microsfere codificate e microsfere magnetiche di polistirene mirate a IL-10 hanno pienamente dimostrato il potenziale del rilevamento digitale ad altissima multiplexing basato su microsfere. Di conseguenza, il sistema BOAD è molto promettente per molte applicazioni che richiedono elevati tassi di incapsulamento di singole particelle all'interno di compartimenti limitati, come i biotest digitali ad altissima multiplexing, analisi di singola cellula, screening farmacologico, e rilevamento di un singolo esosoma.

In tutte le applicazioni, incapsulamento di particelle basato su goccioline (cellule e microsfere) è una piattaforma ideale per l'analisi unicellulare della riprogrammazione cellulare, scoperta di farmaci, e rilevamento delle secrezioni grazie ai diametri del reattore uniformemente piccoli, fenomeni di flusso unici su scala microscopica, e un numero illimitato di unità di isolamento, e consente anche il rilevamento digitale ultrasensibile basato su microsfere di proteine ​​a bassa abbondanza, esosomi, e altre biomolecole.

Riferimento：

[1] Sì, X., Zanna, X., Sole, T., Fare, J., Kuang, X., Guo, Q., Wang, Y., Gu, H. e Xu, H. 2022. Rompere la distribuzione di Poisson: Un sistema microfluidico a goccioline compatto ad alta efficienza per l'incapsulamento di singole sfere e il rilevamento mediante test immunologico digitale. Biosensori e Bioelettronica. 211, (Settembre. 2022), 114384. DOI:https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114384.

[2] Zhou, Y., Mamma, Z., Tayebi, M. e Ai, Y. 2019. Focalizzazione delle particelle submicroniche e ordinamento degli esosomi mediante strutture ondulate a microcanali all'interno di fluidi viscoelastici. Chimica Analitica. 91, 7 (aprile. 2019), 4577–4584. DOI:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b05749.

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