Strategie di base e applicazioni per lo smistamento di frammenti di DNA

Il principio della purificazione delle sfere magnetiche degli acidi nucleici si basa sulla tecnologia di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI), di cui il meccanismo d’azione non è ancora molto chiaro. La teoria del ponte salino è attualmente una spiegazione più scientifica, questo è, in concentrazioni più elevate di alcol e soluzione salina catturano l'acqua dello strato di idratazione esterno alle molecole di DNA, con conseguente aggregazione delle molecole di DNA e precipitazione, in modo che i gruppi fosfato caricati negativamente siano esposti. Gli ioni del sale formano un “ponte salino”, detto anche “ponte elettrico”, con i gruppi sulla superficie delle perle, facendo sì che il DNA venga adsorbito sulla superficie delle perline.

La precipitazione di isopropanolo ed etanolo è troppo potente, quindi l'ordinamento dei frammenti generalmente non viene utilizzato, ma polimeri idrosolubili non ionici PEG, questo è, polietilenglicole come precipitante, e a causa del PEG viscoso in modo che le sfere magnetiche nel tampone ottengano una buona sospensione. Nel processo di legame del DNA, le sfere magnetiche possono essere contattate più pienamente con il DNA, e il PEG non è facile da provocare la denaturazione delle proteine ​​e l'adsorbimento non specifico. Tuttavia, l'effetto di deposizione del DNA del PEG è facilmente influenzato dal pH e dalla temperatura, e il PEG non è facilmente solubile in acqua quando la temperatura è troppo bassa, COSÌ le perle magnetiche generalmente devono essere equilibrati a temperatura ambiente prima dell'uso, e alcuni stabilizzanti a basso pH, come Tris-HCl, ecc., verrà aggiunto al buffer della perla magnetica.

Più lungo è il DNA, i gruppi fosfato con carica negativa sono esposti sulla superficie, più forte è la carica negativa dell'intera molecola, più facile sarà l'adsorbimento sulle sfere magnetiche, e per recuperarlo è necessaria solo una concentrazione inferiore di PEG e NaCl; più corto è il DNA, maggiore è la concentrazione di PEG e NaCl necessaria per distruggere più a fondo lo strato di idratazione sulla superficie, e per esporre un numero sufficiente di gruppi fosfato caricati negativamente da essere adsorbiti dalle sfere magnetiche, e così recuperato. e così si riprese. Quindi se vuoi recuperare frammenti di DNA più corti, è necessario aggiungere un volume maggiore di perline magnetiche (mostrato in Figura 1).

Perciò, la procedura generale di smistamento dei frammenti consiste nell'adsorbire i frammenti di grandi dimensioni con un tampone di perline diluito nel primo ciclo, e quindi aggiungere il tampone di microsfere per assorbire i frammenti specificati nel secondo ciclo dopo aver preso il surnatante, per ottenere il DNA frammentato desiderato. Attualmente, la maggior parte degli schemi di smistamento dei frammenti presenti sul mercato utilizzano sfere carbossilate in combinazione con diverse concentrazioni di ioni salini e percentuali di PEG per recuperare frammenti di diverse lunghezze, ma ovviamente, c'è un altro schema, che è Il metodo dell'apostolo di primi frammenti adsorbenti di grandi dimensioni con sfere magnetiche carbossilate (Substrato A mostrato in Fig. 2) ad una certa concentrazione di ioni salini e PEG, e quindi adsorbendo piccoli frammenti con perline magnetiche idrossilate di silice (Il substrato B mostrato in Fig. 2) ad una certa concentrazione di ioni salini e PEG ^[2].

Il metodo delle perle magnetiche per l'ordinamento dei frammenti è efficiente, rapido, e tecnica altamente specifica, e l'ordinamento dei frammenti è uno dei passaggi chiave nel processo di preparazione della libreria NGS. Attraverso l'ordinamento dei frammenti, può garantire che la dimensione dei frammenti di DNA nella libreria soddisfi i requisiti della piattaforma di sequenziamento, migliorando così la qualità dei dati di sequenziamento e l'accuratezza dell'analisi. Nel campo della diagnostica molecolare, la tecnologia di smistamento dei frammenti viene utilizzata per migliorare la sensibilità e la specificità del rilevamento. Le sfere magnetiche per lo smistamento dei frammenti possono essere utilizzate anche per la purificazione dei prodotti della PCR per esperimenti a valle.

Riferimenti:

[1] LIU D, LIQ, LUO J, ecc. Una strategia di purificazione del DNA basata su microsfere SPRI per flessibilità ed efficacia in termini di costi[J/OL]. Genomica BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, ecc. Arricchimento delle dimensioni del DNA ad alta risoluzione utilizzando una nanopiattaforma magnetica e applicazione nei test prenatali non invasivi[J/OL]. L'analista, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

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