Strategi asas dan aplikasi untuk pengisihan serpihan DNA

Prinsip penulenan manik magnet bagi asid nukleik adalah berdasarkan teknologi Imobilisasi Boleh Balik Fasa Pepejal（SPRI）, yang mekanisme tindakannya masih belum begitu jelas. Teori jambatan garam kini merupakan penjelasan yang lebih saintifik, iaitu, dalam kepekatan alkohol dan larutan garam yang lebih tinggi merampas air lapisan penghidratan di luar molekul DNA, mengakibatkan pengagregatan molekul DNA pemendakan, supaya kumpulan fosfat bercas negatif terdedah. Ion garam membentuk "jambatan garam", juga dipanggil "jambatan elektrik", dengan kumpulan pada permukaan manik, menyebabkan DNA terserap ke permukaan manik.

Kerpasan isopropanol dan etanol adalah terlalu kuat, jadi pengisihan serpihan biasanya tidak digunakan, tetapi polimer larut air bukan ionik PEG, iaitu, polietilena glikol sebagai pemendakan, dan kerana PEG likat supaya manik magnet dalam penimbal untuk mendapatkan penggantungan yang baik. Dalam proses pengikatan DNA, manik magnet boleh lebih bersentuhan sepenuhnya dengan DNA, dan PEG tidak mudah menyebabkan denaturasi protein dan penjerapan tidak spesifik. Namun begitu, kesan pemendapan DNA PEG mudah dipengaruhi oleh pH dan suhu, dan PEG tidak mudah larut dalam air apabila suhu terlalu rendah, jadi manik magnet biasanya perlu diseimbangkan pada suhu bilik sebelum digunakan, dan beberapa penstabil pH rendah, seperti Tris-HCl, dll., akan ditambah kepada penimbal manik magnetik.

Semakin panjang DNA, kumpulan fosfat yang lebih bercas negatif terdedah pada permukaan, semakin kuat cas negatif keseluruhan molekul, semakin mudah ia diserap pada manik magnet, dan hanya kepekatan PEG dan NaCl yang lebih rendah diperlukan untuk memulihkannya; semakin pendek DNA itu, semakin tinggi kepekatan PEG dan NaCl diperlukan untuk memusnahkan lapisan penghidratan pada permukaan dengan lebih teliti, dan untuk mendedahkan kumpulan fosfat bercas negatif yang mencukupi untuk diserap oleh manik magnet, dan dengan itu pulih. dan dengan itu pulih semula. Jadi jika anda ingin memulihkan serpihan DNA yang lebih pendek, anda perlu menambah jumlah manik magnet yang lebih besar (ditunjukkan dalam Rajah 1).

Oleh itu, prosedur am pengasingan serpihan adalah untuk menyerap serpihan besar dengan penimbal manik cair pada pusingan pertama, dan kemudian tambah penampan manik untuk menyerap serpihan yang ditentukan dalam pusingan kedua selepas mengambil supernatan, untuk mendapatkan DNA pecahan yang dikehendaki. Pada masa ini, kebanyakan skim penyisihan serpihan di pasaran menggunakan manik berkarboksilasi dalam kombinasi dengan kepekatan ion garam yang berbeza dan peratusan PEG untuk memulihkan serpihan dengan panjang yang berbeza, tetapi sudah tentu, ada skim lain, iaitu Kaedah Rasul pertama menyerap serpihan besar dengan manik magnet berkarboksilasi (Substrat A ditunjukkan dalam Rajah. 2) pada kepekatan ion garam dan PEG tertentu, dan kemudian menjerap serpihan kecil dengan manik magnet silika-hidroksilasi (Substrat B ditunjukkan dalam Rajah. 2) pada kepekatan ion garam dan PEG tertentu ^[2].

Kaedah manik magnet untuk pengisihan serpihan adalah cekap, pantas, dan teknik yang sangat spesifik, dan pengisihan serpihan adalah salah satu langkah utama dalam proses penyediaan perpustakaan NGS. Melalui pengisihan serpihan, ia boleh memastikan bahawa saiz serpihan DNA dalam perpustakaan memenuhi keperluan platform penjujukan, sekali gus meningkatkan kualiti penjujukan data dan ketepatan analisis. Dalam bidang diagnostik molekul, teknologi pengisihan serpihan digunakan untuk meningkatkan sensitiviti dan kekhususan pengesanan. Manik magnet pengisihan serpihan juga boleh digunakan untuk penulenan produk PCR untuk eksperimen hiliran.

Rujukan:

[1] LIU D, LIQ, LUO J, dll. Strategi penulenan DNA berasaskan manik SPRI untuk fleksibiliti dan keberkesanan kos[J/OL]. BMC Genomics, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, dll. Pengayaan saiz DNA resolusi tinggi menggunakan platform nano magnetik dan aplikasi dalam ujian pranatal bukan invasif[J/OL]. Penganalisis, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

Pembekal

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ditubuhkan pada 2016 yang merupakan pengilang profesional bahan biomagnet dan reagen pengekstrakan asid nukleik.

Kami mempunyai pengalaman yang kaya dalam pengekstrakan dan penulenan asid nukleik, penulenan protein, pemisahan sel, chemiluminescence, dan bidang teknikal yang lain.

Produk kami digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang, seperti ujian perubatan, ujian genetik, penyelidikan universiti, pembiakan genetik, dan seterusnya. Kami bukan sahaja menyediakan produk tetapi juga boleh menjalankan OEM, ODM, dan keperluan lain. Jika anda mempunyai keperluan yang berkaitan, sila hubungi kami disales01@lingjunbio.com.