Strategi dasar dan aplikasi untuk penyortiran fragmen DNA

Prinsip pemurnian manik magnetik asam nukleat didasarkan pada teknologi Imobilisasi Reversibel Fase Padat （SPRI）, yang mekanisme kerjanya masih belum jelas. Teori jembatan garam saat ini penjelasannya lebih ilmiah, yaitu, dalam konsentrasi alkohol dan larutan garam yang lebih tinggi merebut air dari lapisan hidrasi di luar molekul DNA, sehingga terjadi agregasi presipitasi molekul DNA, sehingga gugus fosfat yang bermuatan negatif tersingkap. Ion garam membentuk “jembatan garam”, juga disebut “jembatan listrik”, dengan kelompok pada permukaan manik-manik, menyebabkan DNA teradsorpsi ke permukaan manik-manik.

Pengendapan isopropanol dan etanol terlalu besar, jadi penyortiran fragmen umumnya tidak digunakan, tetapi polimer PEG yang larut dalam air nonionik, yaitu, polietilen glikol sebagai pengendap, dan karena PEG yang kental sehingga manik-manik magnet dalam buffer memperoleh suspensi yang baik. Dalam proses pengikatan DNA, manik-manik magnetik dapat lebih banyak bersentuhan dengan DNA, dan PEG tidak mudah menyebabkan denaturasi protein dan adsorpsi non spesifik. Namun, efek deposisi DNA PEG mudah dipengaruhi oleh pH dan suhu, dan PEG tidak mudah larut dalam air bila suhu terlalu rendah, Jadi manik-manik magnetik umumnya diperlukan untuk diseimbangkan pada suhu kamar sebelum digunakan, dan beberapa stabilisator pH rendah, seperti Tris-HCl, dll., akan ditambahkan ke buffer manik magnetik.

Semakin panjang DNAnya, semakin banyak gugus fosfat bermuatan negatif yang terlihat di permukaan, semakin kuat muatan negatif seluruh molekulnya, semakin mudah untuk diserap ke manik-manik magnetik, dan hanya diperlukan konsentrasi PEG dan NaCl yang lebih rendah untuk memulihkannya; semakin pendek DNA-nya, semakin tinggi konsentrasi PEG dan NaCl yang diperlukan untuk menghancurkan lapisan hidrasi pada permukaan secara lebih menyeluruh, dan untuk memaparkan cukup banyak gugus fosfat bermuatan negatif untuk diadsorpsi oleh manik-manik magnet, dan dengan demikian pulih. dan dengan demikian pulih kembali. Jadi jika Anda ingin memulihkan fragmen DNA yang lebih pendek, Anda perlu menambahkan manik-manik magnetik dengan volume lebih besar (ditunjukkan pada Gambar 1).

Karena itu, prosedur umum penyortiran fragmen adalah dengan mengadsorpsi fragmen besar dengan buffer manik encer pada putaran pertama, dan kemudian menambahkan bead buffer untuk menyerap fragmen yang ditentukan pada putaran kedua setelah mengambil supernatan, untuk mendapatkan DNA terfragmentasi yang diinginkan. Saat ini, sebagian besar skema penyortiran fragmen di pasaran menggunakan manik-manik karboksilasi yang dikombinasikan dengan konsentrasi ion garam dan persentase PEG yang berbeda untuk memulihkan fragmen dengan panjang berbeda, tapi tentu saja, ada skema lain, yang Metode Rasul pertama kali menyerap fragmen besar dengan manik-manik magnetik karboksilat (Substrat A ditunjukkan pada Gambar. 2) pada konsentrasi ion garam dan PEG tertentu, dan kemudian menyerap fragmen kecil dengan manik-manik magnetik silika-hidroksilasi (Substrat B ditunjukkan pada Gambar. 2) pada konsentrasi ion garam dan PEG tertentu ^[2].

Metode manik magnetik untuk penyortiran fragmen adalah metode yang efisien, cepat, dan teknik yang sangat spesifik, dan penyortiran fragmen adalah salah satu langkah penting dalam proses persiapan perpustakaan NGS. Melalui penyortiran fragmen, ini dapat memastikan bahwa ukuran fragmen DNA di perpustakaan memenuhi persyaratan platform pengurutan, sehingga meningkatkan kualitas pengurutan data dan keakuratan analisis. Di bidang diagnostik molekuler, teknologi penyortiran fragmen digunakan untuk meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas deteksi. Manik-manik magnetik penyortiran fragmen juga dapat digunakan untuk pemurnian produk PCR untuk eksperimen hilir.

Referensi:

[1] LIU D, LIQ, LUO J, dll.. Strategi pemurnian DNA berbasis butiran SPRI untuk fleksibilitas dan efektivitas biaya[J/OL]. Genomik BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, dll.. Pengayaan ukuran DNA resolusi tinggi menggunakan platform nano magnetik dan aplikasi dalam pengujian prenatal non-invasif[J/OL]. Analis, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

Pemasok

Shanghai Lingjun Bioteknologi Co., Ltd.didirikan pada 2016 yang merupakan produsen profesional bahan biomagnetik dan reagen ekstraksi asam nukleat.

Kami memiliki pengalaman yang kaya dalam ekstraksi dan pemurnian asam nukleat, pemurnian protein, pemisahan sel, kimialuminesensi, dan bidang teknis lainnya.

Produk kami banyak digunakan di berbagai bidang, misalnya tes kesehatan, pengujian genetik, penelitian universitas, pemuliaan genetik, dan sebagainya. Kami tidak hanya menyediakan produk tetapi juga dapat melakukan OEM, ODM, dan kebutuhan lainnya. Jika Anda memiliki kebutuhan terkait, jangan ragu untuk menghubungi kami dipenjualan01@lingjunbio.com.