डीएनए खंड छँटाई के लिए बुनियादी रणनीतियाँ और अनुप्रयोग

न्यूक्लिक एसिड के चुंबकीय मनका शुद्धिकरण का सिद्धांत सॉलिड-फेज रिवर्सिबल इमोबिलाइजेशन तकनीक (एसपीआरआई) पर आधारित है।, जिनमें से कार्रवाई का तंत्र अभी तक बहुत स्पष्ट नहीं है. साल्ट ब्रिज सिद्धांत वर्तमान में अधिक वैज्ञानिक व्याख्या है, वह है, अल्कोहल और नमक के घोल की उच्च सांद्रता डीएनए अणुओं के बाहर जलयोजन परत के पानी को जब्त कर लेती है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए अणुओं की वर्षा का एकत्रीकरण होता है, ताकि नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए फॉस्फेट समूह उजागर हो जाएं. नमक आयन एक "नमक पुल" बनाते हैं, इसे "विद्युत पुल" भी कहा जाता है, मोतियों की सतह पर समूहों के साथ, जिससे डीएनए मोतियों की सतह पर अवशोषित हो जाता है.

आइसोप्रोपेनॉल और इथेनॉल वर्षा बहुत अधिक शक्तिशाली है, इसलिए आमतौर पर खंड छँटाई का उपयोग नहीं किया जाता है, लेकिन गैर-आयनिक पानी में घुलनशील पॉलिमर पीईजी, वह है, अवक्षेपक के रूप में पॉलीथीन ग्लाइकोल, और चिपचिपी खूंटी के कारण बफर में चुंबकीय मोतियों को एक अच्छा निलंबन प्राप्त होता है. डीएनए बाइंडिंग की प्रक्रिया में, चुंबकीय मोतियों को डीएनए के साथ अधिक पूर्ण रूप से संपर्क किया जा सकता है, और पीईजी प्रोटीन विकृतीकरण और गैर-विशिष्ट सोखना का कारण बनना आसान नहीं है. तथापि, पीईजी का डीएनए जमाव प्रभाव पीएच और तापमान से आसानी से प्रभावित होता है, और तापमान बहुत कम होने पर पीईजी पानी में आसानी से घुलनशील नहीं होता है, इसलिए चुंबकीय मोती आमतौर पर उपयोग से पहले इसे कमरे के तापमान पर संतुलित करना आवश्यक होता है, और कुछ कम पीएच स्टेबलाइजर्स, जैसे ट्रिस-एचसीएल, वगैरह।, चुंबकीय मनका बफर में जोड़ा जाएगा.

डीएनए जितना लंबा होगा, अधिक नकारात्मक रूप से आवेशित फॉस्फेट समूह सतह पर उजागर होते हैं, पूरे अणु का ऋणात्मक आवेश उतना ही मजबूत होता है, इसे चुंबकीय मोतियों में अवशोषित करना उतना ही आसान है, और इसे पुनर्प्राप्त करने के लिए केवल PEG और NaCl की कम सांद्रता की आवश्यकता होती है; DNA उतना ही छोटा होता है, सतह पर जलयोजन परत को अधिक अच्छी तरह से नष्ट करने के लिए PEG और NaCl की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, और चुंबकीय मोतियों द्वारा सोखने के लिए पर्याप्त नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए फॉस्फेट समूहों को उजागर करना, और इस प्रकार ठीक हो गया. और इस प्रकार वापस ठीक हो गया. इसलिए यदि आप छोटे डीएनए अंशों को पुनर्प्राप्त करना चाहते हैं, आपको बड़ी मात्रा में चुंबकीय मोतियों को जोड़ने की आवश्यकता है (चित्र में दिखाया गया है 1).

इसलिए, टुकड़े छँटाई की सामान्य प्रक्रिया पहले दौर में पतले मनका बफर के साथ बड़े टुकड़ों को सोखना है, और फिर सतह पर तैरनेवाला लेने के बाद दूसरे दौर में निर्दिष्ट टुकड़ों को सोखने के लिए मनका बफर जोड़ें, वांछित खंडित डीएनए प्राप्त करने के लिए. वर्तमान में, बाज़ार में अधिकांश टुकड़े छँटाई योजनाएँ अलग-अलग लंबाई के टुकड़ों को पुनर्प्राप्त करने के लिए नमक आयनों की विभिन्न सांद्रता और पीईजी के प्रतिशत के साथ संयोजन में कार्बोक्सिलेटेड मोतियों का उपयोग करती हैं।, लेकिन निश्चित रूप से, एक और योजना है, जो है प्रेरित की विधि सबसे पहले बड़े टुकड़ों को कार्बोक्सिलेटेड चुंबकीय मोतियों से सोखना (सब्सट्रेट ए चित्र में दिखाया गया है. 2) नमक आयनों और पीईजी की एक निश्चित सांद्रता पर, और फिर सिलिका-हाइड्रॉक्सिलेटेड चुंबकीय मोतियों के साथ छोटे टुकड़ों को सोखना (सब्सट्रेट बी चित्र में दिखाया गया है. 2) नमक आयनों और पीईजी की एक निश्चित सांद्रता पर ^[2].

टुकड़ों को छांटने के लिए चुंबकीय मनका विधि एक कुशल है, तेज़, और अत्यधिक विशिष्ट तकनीक, और खंड छँटाई एनजीएस पुस्तकालय तैयारी प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है. खंड छँटाई के माध्यम से, यह सुनिश्चित कर सकता है कि लाइब्रेरी में डीएनए टुकड़ों का आकार अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म की आवश्यकताओं को पूरा करता है, इस प्रकार अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता और विश्लेषण की सटीकता में सुधार हुआ. आणविक निदान के क्षेत्र में, पहचान की संवेदनशीलता और विशिष्टता को बेहतर बनाने के लिए टुकड़े-छँटाई तकनीक का उपयोग किया जाता है. डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए पीसीआर उत्पादों के शुद्धिकरण के लिए टुकड़े को छांटने वाले चुंबकीय मोतियों का भी उपयोग किया जा सकता है.

संदर्भ:

[1] एलआईयू डी, LIQ, लुओ जे, वगैरह. लचीलेपन और लागत-प्रभावशीलता के लिए एक एसपीआरआई मोतियों पर आधारित डीएनए शुद्धिकरण रणनीति[जे/ओएल]. बीएमसी जीनोमिक्स, 2023, 24(1): 125. डीओआई:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] झांग बी, झाओ एस, वान एच, वगैरह. चुंबकीय नैनो-प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन डीएनए आकार संवर्धन और गैर-आक्रामक प्रसव पूर्व परीक्षण में अनुप्रयोग[जे/ओएल]. विश्लेषक, 2020, 145(17): 5733-5739. डीओआई:10.1039/D0AN00813C.

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