Estratégias básicas e aplicação para classificação de fragmentos de DNA

O princípio da purificação de ácidos nucléicos por esferas magnéticas é baseado na tecnologia de imobilização reversível em fase sólida (SPRI), cujo mecanismo de ação ainda não é muito claro. A teoria da ponte salina é atualmente uma explicação mais científica, aquilo é, em concentrações mais altas de álcool e solução salina apreendem a água da camada de hidratação fora das moléculas de DNA, resultando na agregação de precipitação de moléculas de DNA, de modo que os grupos fosfato carregados negativamente sejam expostos. Os íons de sal formam uma “ponte salina”, também chamada de “ponte elétrica”, com os grupos na superfície das contas, fazendo com que o DNA seja adsorvido na superfície das contas.

A precipitação de isopropanol e etanol é muito poderosa, então a classificação de fragmentos geralmente não é usada, mas polímeros não iônicos solúveis em água PEG, aquilo é, polietilenoglicol como precipitante, e por causa do PEG viscoso para que as esferas magnéticas no tampão obtenham uma boa suspensão. No processo de ligação ao DNA, as esferas magnéticas podem entrar em contato mais completo com o DNA, e PEG não é fácil de causar desnaturação de proteínas e adsorção inespecífica. No entanto, o efeito de deposição de DNA do PEG é facilmente afetado pelo pH e pela temperatura, e o PEG não é facilmente solúvel em água quando a temperatura está muito baixa, então as contas magnéticas geralmente precisam ser equilibrados à temperatura ambiente antes do uso, e alguns estabilizadores de pH baixo, como Tris-HCl, etc., será adicionado ao buffer de esfera magnética.

Quanto mais tempo o DNA, quanto mais grupos fosfato carregados negativamente estão expostos na superfície, mais forte é a carga negativa de toda a molécula, mais fácil é ser adsorvido pelas esferas magnéticas, e apenas uma concentração menor de PEG e NaCl é necessária para recuperá-lo; quanto mais curto for o DNA, quanto maior a concentração de PEG e NaCl é necessária para destruir mais completamente a camada de hidratação na superfície, e expor grupos fosfato com carga negativa suficientes para serem adsorvidos pelas esferas magnéticas, e assim se recuperou. e assim se recuperou. Então, se você quiser recuperar fragmentos de DNA mais curtos, você precisa adicionar um volume maior de contas magnéticas (mostrado na Figura 1).

Portanto, o procedimento geral de classificação de fragmentos é adsorver fragmentos grandes com tampão de esfera diluído na primeira rodada, e, em seguida, adicione tampão de esferas para adsorver os fragmentos especificados na segunda rodada após a coleta do sobrenadante, para obter o DNA fragmentado desejado. Atualmente, a maioria dos esquemas de classificação de fragmentos no mercado utiliza esferas carboxiladas em combinação com diferentes concentrações de íons de sal e porcentagens de PEG para recuperar fragmentos de diferentes comprimentos, mas é claro, existe outro esquema, o que é Método do apóstolo da primeira adsorção de grandes fragmentos com esferas magnéticas carboxiladas (Substrato A mostrado na Fig. 2) a uma certa concentração de íons de sal e PEG, e depois adsorver pequenos fragmentos com esferas magnéticas hidroxiladas com sílica (Substrato B mostrado na Fig. 2) a uma certa concentração de íons de sal e PEG ^[2].

O método de esfera magnética para classificação de fragmentos é um método eficiente, rápido, e técnica altamente específica, e a classificação de fragmentos é uma das etapas principais no processo de preparação da biblioteca NGS. Através da classificação de fragmentos, pode garantir que o tamanho dos fragmentos de DNA na biblioteca atenda aos requisitos da plataforma de sequenciamento, melhorando assim a qualidade dos dados de sequenciamento e a precisão da análise. No campo do diagnóstico molecular, a tecnologia de classificação de fragmentos é usada para melhorar a sensibilidade e a especificidade da detecção. Esferas magnéticas de classificação de fragmentos também podem ser usadas para a purificação de produtos de PCR para experimentos posteriores.

Referências:

[1] LIU D, LIQ, LUO J., etc.. Uma estratégia de purificação de DNA baseada em esferas SPRI para flexibilidade e economia[J/OL]. Genômica BMC, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, etc.. Enriquecimento de tamanho de DNA de alta resolução usando nanoplataforma magnética e aplicação em testes pré-natais não invasivos[J/OL]. O Analista, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

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