Basisstrategieën en toepassing voor het sorteren van DNA-fragmenten

Het principe van magnetische kraalzuivering van nucleïnezuren is gebaseerd op Solid-Phase Reversible Immobilization-technologie (SPRI), waarvan het werkingsmechanisme nog niet erg duidelijk is. Zoutbrugtheorie is momenteel een meer wetenschappelijke verklaring, dat is, bij hogere concentraties alcohol en zoutoplossing grijpen ze het water van de hydratatielaag buiten de DNA-moleculen aan, resulterend in aggregatie van precipitatie van DNA-moleculen, zodat de negatief geladen fosfaatgroepen bloot komen te liggen. De zoutionen vormen een ‘zoutbrug’, ook wel een “elektrische brug” genoemd, met de groepen op het oppervlak van de kralen, waardoor het DNA op het oppervlak van de kralen wordt geadsorbeerd.

Isopropanol- en ethanolprecipitatie is te krachtig, dus fragmentsortering wordt over het algemeen niet gebruikt, maar niet-ionische, in water oplosbare polymeren PEG, dat is, polyethyleenglycol als neerslagmiddel, en vanwege het stroperige PEG waardoor de magnetische kralen in de buffer een goede suspensie verkrijgen. In het proces van DNA-binding, de magnetische kralen kunnen vollediger in contact worden gebracht met DNA, en PEG veroorzaakt niet gemakkelijk eiwitdenaturatie en niet-specifieke adsorptie. Echter, het DNA-afzettingseffect van PEG wordt gemakkelijk beïnvloed door pH en temperatuur, en PEG is niet gemakkelijk oplosbaar in water als de temperatuur te laag is, Dus de magnetische kralen moeten over het algemeen vóór gebruik bij kamertemperatuur worden geëquilibreerd, en enkele lage pH-stabilisatoren, zoals Tris-HCl, enz., wordt toegevoegd aan de magnetische kraalbuffer.

Hoe langer het DNA, de meer negatief geladen fosfaatgroepen worden aan het oppervlak blootgesteld, hoe sterker de negatieve lading van het hele molecuul is, hoe gemakkelijker het is om aan de magnetische kralen te worden geadsorbeerd, en er is slechts een lagere concentratie PEG en NaCl nodig om het terug te winnen; hoe korter het DNA is, hoe hoger de concentratie PEG en NaCl nodig is om de hydratatielaag op het oppervlak grondiger te vernietigen, en om voldoende negatief geladen fosfaatgroepen bloot te leggen om door de magnetische kralen te worden geadsorbeerd, en dus hersteld. en dus weer hersteld. Dus als je kortere DNA-fragmenten wilt terughalen, je moet een groter volume magnetische kralen toevoegen (weergegeven in figuur 1).

Daarom, de algemene procedure voor het sorteren van fragmenten is het adsorberen van grote fragmenten met verdunde parelbuffer in de eerste ronde, en voeg vervolgens parelbuffer toe om de gespecificeerde fragmenten in de tweede ronde te adsorberen na het nemen van supernatant, om het gewenste gefragmenteerde DNA te verkrijgen. Momenteel, de meeste fragmentsorteersystemen op de markt gebruiken gecarboxyleerde kralen in combinatie met verschillende concentraties zoutionen en percentages PEG om fragmenten van verschillende lengtes terug te winnen, maar natuurlijk, er is nog een ander schema, dat is Apostel’s methode van het eerst adsorberen van grote fragmenten met gecarboxyleerde magnetische kralen (Substraat A getoond in Fig. 2) bij een bepaalde concentratie zoutionen en PEG, en vervolgens het adsorberen van kleine fragmenten met silica-gehydroxyleerde magnetische kralen (Substraat B getoond in Fig. 2) bij een bepaalde concentratie zoutionen en PEG ^[2].

De magnetische kralenmethode voor het sorteren van fragmenten is efficiënt, snel, en zeer specifieke techniek, en het sorteren van fragmenten is een van de belangrijkste stappen in het voorbereidingsproces van de NGS-bibliotheek. Via fragmentsortering, het kan ervoor zorgen dat de grootte van de DNA-fragmenten in de bibliotheek voldoet aan de eisen van het sequencingplatform, waardoor de kwaliteit van de sequentiegegevens en de nauwkeurigheid van de analyse worden verbeterd. Op het gebied van moleculaire diagnostiek, fragmentsorteertechnologie wordt gebruikt om de gevoeligheid en specificiteit van detectie te verbeteren. Magnetische korrels voor fragmentsortering kunnen ook worden gebruikt voor de zuivering van PCR-producten voor stroomafwaartse experimenten.

Referenties:

[1] LIU D, LIQ, LUO J, enz. Een op SPRI-kralen gebaseerde DNA-zuiveringsstrategie voor flexibiliteit en kosteneffectiviteit[J/OL]. BMC Genomica, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, enz. Verrijking van DNA-grootte met hoge resolutie met behulp van een magnetisch nanoplatform en toepassing bij niet-invasieve prenatale tests[J/OL]. De analist, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

Leverancier

Shanghai Lingjun Biotechnologie Co., Ltd.werd opgericht in 2016 dat een professionele fabrikant is van biomagnetische materialen en reagentia voor nucleïnezuurextractie.

We hebben een rijke ervaring in de extractie en zuivering van nucleïnezuren, eiwit zuivering, cel scheiding, chemiluminescentie, en andere technische gebieden.

Onze producten worden op veel gebieden veel gebruikt, zoals medische testen, genetische testen, universitair onderzoek, genetische veredeling, enzovoort. Wij leveren niet alleen producten, maar kunnen ook OEM ondernemen, ODM, en andere behoeften. Als u een gerelateerde behoefte heeft, neem dan gerust contact met ons op viasales01@lingjunbio.com.