Grunnleggende strategier og anvendelse for DNA-fragmentsortering

Prinsippet for magnetisk perlerensing av nukleinsyrer er basert på Solid-Phase Reversible Immobilization-teknologi (SPRI), hvorav virkningsmekanismen ennå ikke er veldig klar. Saltbroteori er for tiden en mer vitenskapelig forklaring, det vil si, i høyere konsentrasjoner av alkohol og saltløsning beslaglegge vannet i hydreringslaget utenfor DNA-molekylene, resulterer i utfelling av aggregering av DNA-molekyler, slik at de negativt ladede fosfatgruppene blir eksponert. Saltionene danner en "saltbro", også kalt en "elektrisk bro", med gruppene på overflaten av perlene, forårsaker at DNA blir adsorbert på overflaten av kulene.

Isopropanol og etanolutfelling er for mektig, så fragmentsortering brukes vanligvis ikke, men ikke-ioniske vannløselige polymerer PEG, det vil si, polyetylenglykol som utfellingsmiddel, og på grunn av den viskøse PEG slik at de magnetiske perlene i bufferen for å oppnå en god suspensjon. I ferd med DNA-binding, de magnetiske kulene kan bli mer fullstendig kontaktet med DNA, og PEG er ikke lett å forårsake proteindenaturering og uspesifikk adsorpsjon. Imidlertid, DNA-avsetningseffekten til PEG påvirkes lett av pH og temperatur, og PEG er ikke lett løselig i vann når temperaturen er for lav, så de magnetiske perlene er generelt nødvendig å ekvilibreres ved romtemperatur før bruk, og noen lav pH-stabilisatorer, slik som Tris-HCl, osv., vil bli lagt til den magnetiske perlebufferen.

Jo lengre DNA, de mer negativt ladede fosfatgruppene er eksponert på overflaten, jo sterkere er den negative ladningen til hele molekylet, jo lettere er det å bli adsorbert til de magnetiske kulene, og bare en lavere konsentrasjon av PEG og NaCl er nødvendig for å gjenvinne det; jo kortere er DNA, jo høyere konsentrasjon av PEG og NaCl er nødvendig for å ødelegge hydreringslaget på overflaten mer grundig, og å eksponere nok negativt ladede fosfatgrupper til å bli adsorbert av de magnetiske kulene, og ble dermed frisk. og kom seg dermed tilbake. Så hvis du ønsker å gjenopprette kortere DNA-fragmenter, du må legge til et større volum av magnetiske perler (vist i figur 1).

Derfor, den generelle prosedyren for fragmentsortering er å adsorbere store fragmenter med fortynnet perlebuffer i første runde, og tilsett deretter perlebuffer for å adsorbere de spesifiserte fragmentene i andre runde etter å ha tatt supernatanten, for å få ønsket fragmentert DNA. For tiden, de fleste av fragmentsorteringsordningene på markedet bruker karboksylerte perler i kombinasjon med forskjellige konsentrasjoner av saltioner og prosentandeler av PEG for å gjenvinne fragmenter av forskjellig lengde, men selvfølgelig, det er en annen ordning, som er Apostelens metode av første adsorbering av store fragmenter med karboksylerte magnetiske perler (Substrat A vist i fig. 2) ved en viss konsentrasjon av saltioner og PEG, og deretter adsorbere små fragmenter med silika-hydroksylerte magnetiske kuler (Substrat B vist i fig. 2) ved en viss konsentrasjon av saltioner og PEG ^[2].

Den magnetiske perlemetoden for fragmentsortering er en effektiv, rask, og svært spesifikk teknikk, og fragmentsortering er et av nøkkeltrinnene i NGS-bibliotekets forberedelsesprosess. Gjennom fragmentsortering, det kan sikre at størrelsen på DNA-fragmenter i biblioteket oppfyller kravene til sekvenseringsplattformen, dermed forbedre kvaliteten på sekvenseringsdata og nøyaktigheten av analysen. Innen molekylær diagnostikk, fragmentsorteringsteknologi brukes for å forbedre sensitiviteten og spesifisiteten til deteksjon. Fragmentsortering av magnetiske perler kan også brukes til rensing av PCR-produkter for nedstrøms eksperimenter.

Referanser:

[1] LIU D, LIQ, LUO J, osv. En SPRI-perlebasert DNA-rensestrategi for fleksibilitet og kostnadseffektivitet[J/OL]. BMC Genomics, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, osv. Høyoppløselig anrikning av DNA-størrelse ved bruk av en magnetisk nanoplattform og applikasjon i ikke-invasiv prenatal testing[J/OL]. Analytikeren, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ble etablert i 2016 som er en profesjonell produsent av biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraksjonsreagenser.

Vi har rik erfaring innen utvinning og rensing av nukleinsyre, proteinrensing, celleseparasjon, kjemiluminescens, og andre tekniske felt.

Våre produkter er mye brukt på mange felt, som medisinsk testing, genetisk testing, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke bare produkter, men kan også påta oss OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relatert behov, ta gjerne kontakt med oss ​​påsales01@lingjunbio.com.