Grundlegende Strategien und Anwendung für die Sortierung von DNA-Fragmenten

Das Prinzip der Magnetkügelchen-Reinigung von Nukleinsäuren basiert auf der Technologie der reversiblen Festphasen-Immobilisierung (SPRI)., Der Wirkungsmechanismus ist noch nicht ganz klar. Die Salzbrückentheorie ist derzeit eine wissenschaftlichere Erklärung, das heißt, Bei höheren Konzentrationen von Alkohol und Salzlösung greift das Wasser der Hydratationsschicht außerhalb der DNA-Moleküle, Dies führt zur Aggregation von DNA-Molekülen und zur Ausfällung, sodass die negativ geladenen Phosphatgruppen freigelegt werden. Die Salzionen bilden eine „Salzbrücke“, auch „elektrische Brücke“ genannt, mit den Gruppen auf der Oberfläche der Perlen, Dadurch wird die DNA an der Oberfläche der Perlen adsorbiert.

Die Ausfällung von Isopropanol und Ethanol ist zu stark, Daher wird die Fragmentsortierung im Allgemeinen nicht verwendet, aber nichtionische wasserlösliche Polymere PEG, das heißt, Polyethylenglykol als Fällungsmittel, und aufgrund des viskosen PEG sorgen die Magnetkügelchen im Puffer für eine gute Suspension. Im Prozess der DNA-Bindung, Die Magnetkügelchen können vollständiger mit der DNA kontaktiert werden, und PEG kann nicht leicht zu Proteindenaturierung und unspezifischer Adsorption führen. Jedoch, Der DNA-Ablagerungseffekt von PEG wird leicht durch pH-Wert und Temperatur beeinflusst, und PEG ist in Wasser nicht leicht löslich, wenn die Temperatur zu niedrig ist, Also die magnetischen Perlen Im Allgemeinen müssen sie vor der Verwendung bei Raumtemperatur äquilibriert werden, und einige Stabilisatoren mit niedrigem pH-Wert, wie Tris-HCl, usw., wird dem magnetischen Bead-Puffer hinzugefügt.

Je länger die DNA, die stärker negativ geladenen Phosphatgruppen werden an der Oberfläche freigelegt, desto stärker ist die negative Ladung des gesamten Moleküls, desto einfacher ist die Adsorption an den Magnetkügelchen, und zur Rückgewinnung ist nur eine geringere Konzentration an PEG und NaCl erforderlich; desto kürzer ist die DNA, Je höher die Konzentration an PEG und NaCl ist, desto gründlicher wird die Hydratationsschicht auf der Oberfläche zerstört, und um genügend negativ geladene Phosphatgruppen freizulegen, um von den Magnetkügelchen adsorbiert zu werden, und somit genesen. und erholte sich somit wieder. Wenn Sie also kürzere DNA-Fragmente wiederherstellen möchten, Sie müssen eine größere Menge magnetischer Perlen hinzufügen (in der Abbildung dargestellt 1).

daher, Das allgemeine Verfahren der Fragmentsortierung besteht darin, große Fragmente in der ersten Runde mit verdünntem Perlenpuffer zu adsorbieren, und fügen Sie dann Perlenpuffer hinzu, um die angegebenen Fragmente in der zweiten Runde nach der Entnahme des Überstands zu adsorbieren, um die gewünschte fragmentierte DNA zu erhalten. Momentan, Die meisten Fragmentsortiersysteme auf dem Markt verwenden carboxylierte Perlen in Kombination mit unterschiedlichen Salzionenkonzentrationen und PEG-Prozentsätzen, um Fragmente unterschiedlicher Länge zu gewinnen, aber natürlich, es gibt noch ein anderes Schema, Welches ist Methode des Apostels zunächst große Fragmente mit carboxylierten Magnetkügelchen zu adsorbieren (Substrat A, dargestellt in Abb. 2) bei einer bestimmten Konzentration an Salzionen und PEG, und dann Adsorption kleiner Fragmente mit Silica-hydroxylierten Magnetkügelchen (Substrat B, dargestellt in Abb. 2) bei einer bestimmten Konzentration an Salzionen und PEG ^[2].

Die Magnetkügelchenmethode zur Fragmentsortierung ist eine effiziente Methode, schnell, und hochspezifische Technik, und die Fragmentsortierung ist einer der Schlüsselschritte im Vorbereitungsprozess der NGS-Bibliothek. Durch Fragmentsortierung, Dadurch kann sichergestellt werden, dass die Größe der DNA-Fragmente in der Bibliothek den Anforderungen der Sequenzierungsplattform entspricht, Dadurch wird die Qualität der Sequenzierungsdaten und die Genauigkeit der Analyse verbessert. Im Bereich der molekularen Diagnostik, Zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises wird die Fragmentsortierungstechnologie eingesetzt. Magnetische Beads zur Fragmentsortierung können auch zur Reinigung von PCR-Produkten für nachgelagerte Experimente verwendet werden.

Referenzen:

[1] LIU D, LIQ, LUO J, usw. Eine auf SPRI-Kügelchen basierende DNA-Reinigungsstrategie für Flexibilität und Kosteneffizienz[J/OL]. BMC-Genomik, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, usw. Hochauflösende DNA-Größenanreicherung mithilfe einer magnetischen Nanoplattform und Anwendung in nicht-invasiven pränatalen Tests[J/OL]. Der Analyst, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

Anbieter

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.wurde gegründet in 2016 Das ist ein professioneller Hersteller von biomagnetischen Materialien und Nukleinsäure-Extraktionsreagenzien.

Wir verfügen über umfangreiche Erfahrung in der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren, Proteinreinigung, Zelltrennung, Chemilumineszenz, und anderen technischen Bereichen.

Unsere Produkte werden in vielen Bereichen weit verbreitet eingesetzt, wie zum Beispiel medizinische Tests, Gentests, universitäre Forschung, genetische Zucht, und so weiter. Wir liefern nicht nur Produkte, sondern können auch OEM übernehmen, ODM, und andere Bedürfnisse. Wenn Sie einen entsprechenden Bedarf haben, Bitte kontaktieren Sie uns untersales01@lingjunbio.com.