Digitale PCR-Technologie:Prinzipien, Operationen, und Anwendungen

1. Experimentelles Prinzip der digitalen PCR

Digitale PCR (dPCR) ist eine fortschrittliche Technik zur absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen. Sein Kern liegt in der Verteilung der Probe auf eine große Anzahl unabhängiger Mikroreaktionseinheiten zur PCR-Amplifikation. Jede Mikroreaktionseinheit kann ein oder kein Zielmolekül enthalten. Nach PCR-Amplifikation, Fluoreszenzsignale werden in jeder Einheit erfasst. Letztlich, Die Berechnung der absoluten Anzahl der Zielmoleküle erfolgt nach dem Poisson-Verteilungsprinzip. Im Vergleich zu traditionell quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR (qPCR), Die digitale PCR ist nicht auf die Standardkurve angewiesen und kann direkt eine absolute Quantifizierung durchführen.

2. Betriebsschritte der digitalen PCR

Probenvorbereitung: Erste, Nukleinsäuren wie genomische DNA (gDNA) oder mRNA werden aus Zielgeweben oder Proben extrahiert, und mRNA wird in cDNA umgewandelt.

Vorbereitung des Reaktionssystems: Mischen Sie die extrahierten Nukleinsäuren mit dem Mastermix, zielspezifische Primer, und Sonden. Für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), Es ist auch Öl zur Tröpfchenerzeugung erforderlich.

Tröpfchenerzeugung: Die vorbereitete Reaktionsmischung wird durch einen Tröpfchengenerator verarbeitet, um Tausende von Tröpfchen in Nanolitergröße zu erzeugen. Jedes Tröpfchen kann ein oder kein Zielmolekül enthalten.

PCR-Amplifikation: Die vertropfte Reaktionsplatte wird zur Amplifikation in ein PCR-Gerät gegeben. Während der Verstärkung, Zielmoleküle werden verstärkt, und nach und nach treten Fluoreszenzsignale auf.

Tröpfchenerkennung: Nach der Verstärkung, Die Reaktionsplatte wird in ein Tröpfchenlesegerät gestellt, um die Fluoreszenzsignale jedes Tröpfchens zu erfassen.

Datenanalyse: Die Software analysiert automatisch die Fluoreszenzsignale jedes Tröpfchens und berechnet die absolute Anzahl der Zielmoleküle basierend auf dem Anteil positiver Tröpfchen und der Poisson-Verteilung.

3. Ergebnisanalyse der digitalen PCR

Bei digitalen PCR-Experimenten, Die Ergebnisanalyse basiert hauptsächlich auf der Erkennung von Fluoreszenzsignalen von Tröpfchen. Die Fluoreszenzsignale jedes Tropfens werden als positiv kategorisiert (Zielmoleküle vorhanden) oder negativ (Zielmoleküle fehlen). Durch Zählen der Anzahl positiver Tröpfchen und Verwenden der Poisson-Verteilungsformel, die absolute Kopienzahl der Zielmoleküle in der Probe kann berechnet werden. Zusätzlich, Die digitale PCR-Technologie ist hochempfindlich und spezifisch, ist in der Lage, Zielmoleküle mit geringer Häufigkeit nachzuweisen, und bleibt von der Verstärkungseffizienz unbeeinflusst.

4. Anwendungen der digitalen PCR

Die digitale PCR-Technologie hat ein breites Anwendungsspektrum in verschiedenen Bereichen.

Erkennung von Genmutationen: Es kann Mutationen mit geringer Häufigkeit erkennen, Geeignet für die Krebsfrüherkennung und -überwachung.

Erkennung von Kopienanzahlvariationen: Wird verwendet, um Variationen der Kopienzahl im Genom zu analysieren, wie zum Beispiel Chromosomenanomalien.

Nachweis von Viren und Mikroorganismen: Es kann Viruslasten und Mikrobenzahlen genau erkennen, das zur Diagnose und Überwachung von Infektionskrankheiten geeignet ist.

Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel: Wird verwendet, um das Vorhandensein gentechnisch veränderter Bestandteile in Lebensmitteln festzustellen.

Einzelzellforschung: Es kann die Genexpression und den Proteingehalt einzelner Zellen erkennen.

Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) Validierung: Wird verwendet, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der NGS-Sequenzierungsergebnisse zu überprüfen.

Zusammenfassend, digitale PCR-Technologie, mit seiner hohen Empfindlichkeit, Genauigkeit, und absolute Quantifizierungsvorteile, hat großes Potenzial in der biomedizinischen Forschung und klinischen Diagnostik gezeigt. Da sich die Technologie weiterentwickelt und die Kosten sinken, Es wird erwartet, dass die digitale PCR in weiteren Bereichen breite Anwendung findet.

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