Tecnología de PCR digital:Principios, Operaciones, y aplicaciones

1. Principio experimental de la PCR digital

PCR digitales (dPCR) es una técnica avanzada de cuantificación absoluta de moléculas de ácido nucleico. Su núcleo radica en dispersar la muestra en una gran cantidad de unidades de microrreacción independientes para la amplificación por PCR.. Cada unidad de microrreacción puede contener una o ninguna molécula objetivo.. Después de la amplificación por PCR, Se detectan señales de fluorescencia en cada unidad.. Al final, el número absoluto de moléculas diana se calcula según el principio de distribución de Poisson. Comparado con el tradicional PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real (qPCR), La PCR digital no depende de la curva estándar y puede realizar directamente una cuantificación absoluta.

2. Pasos operativos de la PCR digital

Preparación de muestras: Primero, Ácidos nucleicos como el ADN genómico. (ADNg) o el ARNm se extrae de muestras o tejidos diana, y el ARNm se convierte en ADNc.

Preparación del sistema de reacción: Mezclar los ácidos nucleicos extraídos con la mezcla maestra., cebadores específicos del objetivo, y sondas. Para PCR digital de gotas (ddPCR), También se requiere aceite de generación de gotas..

Generación de gotas: La mezcla de reacción preparada se procesa a través de un generador de gotas para crear miles de gotas del tamaño de nanolitros.. Cada gota puede contener una o ninguna molécula objetivo..

Amplificación por PCR: La placa de reacción con gotas se coloca en un instrumento de PCR para su amplificación.. Durante la amplificación, Las moléculas diana se amplifican., y las señales de fluorescencia aparecen gradualmente.

Detección de gotas: Después de la amplificación, la placa de reacción se coloca en un lector de gotas para detectar las señales de fluorescencia de cada gota.

Análisis de datos: El software analiza automáticamente las señales de fluorescencia de cada gota y calcula el número absoluto de moléculas objetivo en función de la proporción de gotas positivas y la distribución de Poisson..

3. Análisis de resultados de PCR digital

En experimentos de PCR digital, El análisis de resultados se basa principalmente en la detección de señales de fluorescencia de gotas.. Las señales de fluorescencia de cada gota se clasifican como positivas. (moléculas diana presentes) o negativo (moléculas diana ausentes). Contando el número de gotas positivas y utilizando la fórmula de distribución de Poisson, se puede calcular el número absoluto de copias de las moléculas diana en la muestra. Además, La tecnología de PCR digital es altamente sensible y específica., capaz de detectar moléculas objetivo de baja abundancia, y no se ve afectado por la eficiencia de amplificación.

4. Aplicaciones de la PCR digital

La tecnología de PCR digital tiene una amplia gama de aplicaciones en diversos campos.

Detección de mutaciones genéticas: Puede detectar mutaciones de baja abundancia., adecuado para la detección y el seguimiento tempranos del cáncer.

Detección de variación del número de copias: Se utiliza para analizar variaciones en el número de copias en el genoma., como anomalías cromosómicas.

Detección de virus y microorganismos: Puede detectar con precisión cargas virales y números microbianos., que es adecuado para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades infecciosas.

Detección de alimentos genéticamente modificados: Se utiliza para detectar la presencia de componentes genéticamente modificados en los alimentos..

Investigación unicelular: Puede detectar la expresión genética y los niveles de proteínas de células individuales..

Secuenciación de próxima generación (NGS) Validación: Se utiliza para verificar la precisión y confiabilidad de los resultados de la secuenciación NGS..

En resumen, tecnología de PCR digital, con su alta sensibilidad, exactitud, y ventajas absolutas de cuantificación, ha demostrado un gran potencial en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico. A medida que la tecnología se desarrolla y los costos disminuyen, Se espera que la PCR digital se aplique ampliamente en más campos..

Proveedor

Shanghai Lingjun Biotecnología Co., Limitado.se estableció en 2016 que es un fabricante profesional de materiales biomagnéticos y reactivos de extracción de ácidos nucleicos..

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