Technologie PCR numérique:Principes, Opérations, et applications

1. Principe expérimental de la PCR numérique

PCR numérique (dPCR) est une technique avancée de quantification absolue des molécules d'acide nucléique. Son cœur réside dans la dispersion de l’échantillon dans un grand nombre d’unités de micro-réaction indépendantes pour l’amplification PCR.. Chaque unité de micro-réaction peut contenir une ou zéro molécule cible. Après amplification PCR, les signaux de fluorescence sont détectés dans chaque unité. Finalement, le nombre absolu de molécules cibles est calculé sur la base du principe de distribution de Poisson. Par rapport au traditionnel PCR quantitative fluorescente en temps réel (qPCR), la PCR numérique ne s'appuie pas sur la courbe étalon et peut effectuer directement une quantification absolue.

2. Étapes opérationnelles de la PCR numérique

Préparation des échantillons: D'abord, les acides nucléiques tels que l'ADN génomique (ADNg) ou l'ARNm sont extraits de tissus ou d'échantillons cibles, et l'ARNm est converti en ADNc.

Préparation du système de réaction: Mélanger les acides nucléiques extraits avec le master mix, amorces spécifiques à une cible, et sondes. Pour PCR numérique en gouttelettes (ddPCR), de l'huile de génération de gouttelettes est également requise.

Génération de gouttelettes: Le mélange réactionnel préparé est traité via un générateur de gouttelettes pour créer des milliers de gouttelettes de la taille d'un nanolitre.. Chaque gouttelette peut contenir une ou zéro molécule cible.

Amplification PCR: La plaque de réaction en gouttelettes est placée dans un instrument PCR pour amplification. Pendant l'amplification, les molécules cibles sont amplifiées, et des signaux de fluorescence apparaissent progressivement.

Détection de gouttelettes: Après amplification, la plaque de réaction est placée dans un lecteur de gouttelettes pour détecter les signaux de fluorescence de chaque gouttelette.

Analyse des données: Le logiciel analyse automatiquement les signaux de fluorescence de chaque gouttelette et calcule le nombre absolu de molécules cibles en fonction de la proportion de gouttelettes positives et de la distribution de Poisson..

3. Analyse des résultats de la PCR numérique

Dans les expériences de PCR numérique, l'analyse des résultats repose principalement sur la détection des signaux de fluorescence des gouttelettes. Les signaux de fluorescence de chaque gouttelette sont classés comme positifs (molécules cibles présentes) ou négatif (molécules cibles absentes). En comptant le nombre de gouttelettes positives et en utilisant la formule de distribution de Poisson, le nombre absolu de copies des molécules cibles dans l'échantillon peut être calculé. En plus, la technologie PCR numérique est très sensible et spécifique, capable de détecter des molécules cibles en faible abondance, et n'est pas affecté par l'efficacité de l'amplification.

4. Applications de la PCR numérique

La technologie PCR numérique a un large éventail d'applications dans divers domaines.

Détection des mutations génétiques: Il peut détecter des mutations en faible abondance, adapté au dépistage et à la surveillance précoce du cancer.

Détection de variation du numéro de copie: Utilisé pour analyser les variations du nombre de copies dans le génome, comme des anomalies chromosomiques.

Détection de virus et de micro-organismes: Il peut détecter avec précision les charges virales et le nombre de microbes, qui convient au diagnostic et à la surveillance des maladies infectieuses.

Détection des aliments génétiquement modifiés: Utilisé pour détecter la présence de composants génétiquement modifiés dans les aliments.

Recherche unicellulaire: Il peut détecter l’expression des gènes et les niveaux de protéines à partir de cellules individuelles.

Séquençage de nouvelle génération (NGS) Validation: Utilisé pour vérifier l'exactitude et la fiabilité des résultats de séquençage NGS.

En résumé, technologie PCR numérique, avec sa haute sensibilité, précision, et des avantages absolus en matière de quantification, a montré un grand potentiel dans la recherche biomédicale et le diagnostic clinique. À mesure que la technologie évolue et que les coûts diminuent, la PCR numérique devrait être largement appliquée dans davantage de domaines.

Fournisseur

Société de biotechnologie Shanghai Lingjun., Ltd.a été établi en 2016 qui est un fabricant professionnel de matériaux biomagnétiques et de réactifs d'extraction d'acide nucléique.

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