Tecnologia PCR Digital:Princípios, Operações, e aplicativos

1. Princípio Experimental de PCR Digital

PCR digital (dPCR) é uma técnica avançada de quantificação absoluta de moléculas de ácido nucleico. Seu núcleo reside na dispersão da amostra em um grande número de unidades de microrreação independentes para amplificação por PCR. Cada unidade de microrreação pode conter uma ou nenhuma molécula alvo. Após amplificação por PCR, sinais de fluorescência são detectados em cada unidade. Em última análise, o número absoluto de moléculas alvo é calculado com base no princípio de distribuição de Poisson. Comparado ao tradicional PCR quantitativo fluorescente em tempo real (qPCR), PCR digital não depende da curva padrão e pode realizar quantificação absoluta diretamente.

2. Etapas Operacionais do PCR Digital

Preparação de Amostras: Primeiro, ácidos nucléicos, como DNA genômico (gDNA) ou mRNA são extraídos de tecidos ou amostras alvo, e o mRNA é convertido em cDNA.

Preparação do Sistema de Reação: Misture os ácidos nucleicos extraídos com a mistura mestre, primers específicos do alvo, e sondas. Para PCR digital de gotículas (ddPCR), óleo de geração de gotículas também é necessário.

Geração de gotículas: A mistura de reação preparada é processada através de um gerador de gotículas para criar milhares de gotículas do tamanho de nanolitros. Cada gota pode conter uma ou nenhuma molécula alvo.

Amplificação PCR: A placa de reação gotejada é colocada em um instrumento de PCR para amplificação. Durante a amplificação, moléculas alvo são amplificadas, e sinais de fluorescência aparecem gradualmente.

Detecção de gotículas: Após amplificação, a placa de reação é colocada em um leitor de gotas para detectar os sinais de fluorescência de cada gota.

Análise de dados: O software analisa automaticamente os sinais de fluorescência de cada gota e calcula o número absoluto de moléculas alvo com base na proporção de gotas positivas e na distribuição de Poisson.

3. Análise de Resultados de PCR Digital

Em experimentos de PCR digital, a análise de resultados depende principalmente da detecção de sinais de fluorescência de gotículas. Os sinais de fluorescência de cada gota são categorizados como positivos (moléculas alvo presentes) ou negativo (moléculas alvo ausentes). Contando o número de gotículas positivas e usando a fórmula de distribuição de Poisson, o número absoluto de cópias de moléculas alvo na amostra pode ser calculado. Adicionalmente, a tecnologia de PCR digital é altamente sensível e específica, capaz de detectar moléculas alvo de baixa abundância, e não é afetado pela eficiência de amplificação.

4. Aplicações de PCR Digital

A tecnologia de PCR digital tem uma ampla gama de aplicações em vários campos.

Detecção de mutação genética: Pode detectar mutações de baixa abundância, adequado para rastreamento e monitoramento precoce do câncer.

Detecção de variação de número de cópia: Usado para analisar variações no número de cópias no genoma, como anomalias cromossômicas.

Detecção de vírus e microrganismos: Ele pode detectar com precisão cargas virais e números microbianos, que é adequado para o diagnóstico e monitoramento de doenças infecciosas.

Detecção de alimentos geneticamente modificados: Usado para detectar a presença de componentes geneticamente modificados em alimentos.

Pesquisa unicelular: Ele pode detectar a expressão genética e os níveis de proteína de células individuais.

Sequenciamento de próxima geração (NGS) Validação: Usado para verificar a precisão e confiabilidade dos resultados de sequenciamento NGS.

Resumindo, tecnologia PCR digital, com sua alta sensibilidade, precisão, e vantagens de quantificação absoluta, tem demonstrado grande potencial em pesquisa biomédica e diagnóstico clínico. À medida que a tecnologia se desenvolve e os custos diminuem, espera-se que o PCR digital seja amplamente aplicado em mais campos.

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