Tecnologia PCR digitale:Principi, Operazioni, e applicazioni

1. Principio sperimentale della PCR digitale

PCR digitale (dPCR) è una tecnica avanzata di quantificazione assoluta delle molecole di acido nucleico. Il suo nucleo risiede nella dispersione del campione in un gran numero di unità di microreazione indipendenti per l'amplificazione PCR. Ciascuna unità di microreazione può contenere una o zero molecole bersaglio. Dopo l'amplificazione PCR, i segnali di fluorescenza vengono rilevati in ciascuna unità. In definitiva, il numero assoluto di molecole bersaglio viene calcolato in base al principio di distribuzione di Poisson. Rispetto al tradizionale PCR quantitativa fluorescente in tempo reale (qPCR), la PCR digitale non si basa sulla curva standard e può eseguire direttamente la quantificazione assoluta.

2. Fasi operative della PCR digitale

Preparazione del campione: Primo, acidi nucleici come il DNA genomico (gDNA) o l'mRNA vengono estratti da tessuti o campioni bersaglio, e l'mRNA viene convertito in cDNA.

Preparazione del sistema di reazione: Mescolare gli acidi nucleici estratti con la master mix, primer specifici per il bersaglio, e sonde. Per PCR digitale droplet (ddPCR), è necessario anche l'olio per la generazione di goccioline.

Generazione di goccioline: La miscela di reazione preparata viene elaborata attraverso un generatore di gocce per creare migliaia di goccioline delle dimensioni di un nanolitro. Ciascuna gocciolina può contenere una o zero molecole bersaglio.

Amplificazione PCR: La piastra di reazione gocciolata viene posizionata in uno strumento PCR per l'amplificazione. Durante l'amplificazione, le molecole bersaglio vengono amplificate, e i segnali di fluorescenza appaiono gradualmente.

Rilevamento di goccioline: Dopo l'amplificazione, la piastra di reazione viene posizionata in un lettore di gocce per rilevare i segnali di fluorescenza di ciascuna goccia.

Analisi dei dati: Il software analizza automaticamente i segnali di fluorescenza di ciascuna gocciolina e calcola il numero assoluto di molecole target in base alla proporzione di goccioline positive e alla distribuzione di Poisson.

3. Analisi dei risultati della PCR digitale

Negli esperimenti di PCR digitale, l'analisi dei risultati si basa principalmente sul rilevamento dei segnali di fluorescenza provenienti dalle goccioline. I segnali di fluorescenza di ciascuna gocciolina sono classificati come positivi (molecole bersaglio presenti) o negativo (molecole bersaglio assenti). Contando il numero di goccioline positive e utilizzando la formula di distribuzione di Poisson, è possibile calcolare il numero assoluto di copie delle molecole target nel campione. Inoltre, la tecnologia PCR digitale è altamente sensibile e specifica, in grado di rilevare molecole bersaglio a bassa abbondanza, e non è influenzato dall'efficienza dell'amplificazione.

4. Applicazioni della PCR digitale

La tecnologia PCR digitale ha una vasta gamma di applicazioni in vari campi.

Rilevazione di mutazioni genetiche: Può rilevare mutazioni a bassa abbondanza, adatto per lo screening e il monitoraggio precoce del cancro.

Rilevamento della variazione del numero di copie: Utilizzato per analizzare le variazioni del numero di copie nel genoma, come le anomalie cromosomiche.

Rilevazione di virus e microrganismi: Può rilevare con precisione la carica virale e il numero microbico, adatto alla diagnosi e al monitoraggio delle malattie infettive.

Rilevazione di alimenti geneticamente modificati: Utilizzato per rilevare la presenza di componenti geneticamente modificati negli alimenti.

Ricerca sulla singola cellula: Può rilevare l'espressione genica e i livelli proteici di singole cellule.

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) Validazione: Utilizzato per verificare l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati del sequenziamento NGS.

In sintesi, tecnologia PCR digitale, con la sua elevata sensibilità, precisione, e vantaggi assoluti di quantificazione, ha mostrato un grande potenziale nella ricerca biomedica e nella diagnostica clinica. Man mano che la tecnologia si sviluppa e i costi diminuiscono, Si prevede che la PCR digitale verrà ampiamente applicata in più campi.

Fornitore

Shanghai Lingjun Biotecnologia Co., Ltd.è stato fondato nel 2016 che è un produttore professionale di materiali biomagnetici e reagenti per l'estrazione degli acidi nucleici.

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