Sådan vælges det interne referencegen af ​​transgene ris til PCR-identifikation?

1. Udvælgelsesstrategi for referencegener

Identifikation og screening af referencegener er grundlæggende for at sikre pålideligheden af ​​eksperimentelle resultater inden for forskning i transgen ris.

2.1Grundlæggende principper for udvælgelse

Ideelle referencegener bør udvise stabil ekspression på tværs af forskellige væv, organer, udviklingsstadier, og eksperimentelle forhold. Et bredt accepteret kriterium er en Cq-værdi (Kvantificeringscyklus) variationsområde på mindre end 2.5.

2.2Foreløbig screening ved hjælp af offentlige databaser

Brug offentlige databaser såsom IC4R (Information Commons for Rice) og RiceXRro (Rice Expression Profile Database) til indledende screening. Bioinformatikanalyse kan hjælpe med at identificere kandidatgener med stabil ekspression under forskellige forhold.

2.3Evaluering af traditionelle og nye gener

(1) Traditionelle gener: Almindeligt anvendte referencegener inkluderer OsSBE4, RbcS, Akt 1, og SPS (Saccharosephosphatsyntasegen).

(2) Nye stabile gener: Nogle undersøgelser anbefaler nyere referencegener med demonstreret stabilitet, såsom UFC1 (Homolog af UFM1-konjugerende enzym 1) og FhaB (Homolog af Adhesin FhaB), som kan udkonkurrere traditionelle i specifikke sammenhænge.

2. Eksperimentelle valideringstrin

Efter valg af kandidatreferencegener, eksperimentel validering er påkrævet, som primært omfatter følgende trin:

2.1Forberedelse af eksperimentelle materialer

Saml et varieret sæt risprøver, repræsenterer forskellige sorter (f.eks., japonica og indica), væv/organer (f.eks., rødder, stængler, blade, støvknapper, frø), udviklingsstadier, og behandlingsforhold (f.eks., biotisk/abiotisk stress). Medtag specifikke transgene materialer, hvis det er relevant.

2.2RNA-ekstraktion og cDNA-syntese

Udtræk total-RNA af høj kvalitet ved hjælp af pålidelige kits og omvendt transskribering til cDNA. Det er bydende nødvendigt at kontrollere RNA's renhed og integritet.

Bruger Shanghai LNJNBio Plant Total RNA Extraction Kit(Magnetisk perlemetode) ekstrahere 20mg forskellige slags planteblade-RNA，resultat som vist nedenfor：

Elektroferogrammet er vist nedenfor：

2.3 Primer og sondedesign

Design primere og prober til kvantitativ real-time PCR (qPCR) målrettet mod kandidatreferencegenerne. Nøgleovervejelser omfatter:

• Primere bør spænde over exon-exon-forbindelser for at forhindre genomisk DNA-amplifikation.
• Amplikonlængden bør ideelt set være mellem 80-200 bp.
• Anvend TaqMan-probemetoden, når der kræves højere specificitet.

2.4qPCR-udførelse og stabilitetsvurdering

• Udfør qPCR-amplifikation ved hjælp af SYBR Green eller TaqMan kemi.
• Registrer og analyser Cq-værdierne for hvert kandidatgen på tværs af alle prøver.
• Brug specialiserede algoritmer (f.eks., geNorm, NormFinder, BestKeeper) at evaluere ekspressionsstabilitet og vælge det mest stabile referencegen(s).

3. Anvendelser i transgen forskning

Validerede referencegener er afgørende for forskellige anvendelser i transgene risundersøgelser:

3.1Bestemmelse af transgenkopinummer

Brug qPCR eller digital PCR (dPCR) med et enkeltkopi referencegen som en kalibrator til kvantitativ bestemmelse af kopiantallet af integreret T-DNA i risgenomet.

3.2Hurtig screening af homozygote transgene linier

Anvend qPCR-analyse, der sammenligner reference- og transgensignaler (f.eks., via ΔΔCt-metoden) til nøjagtigt at identificere homozygote enkeltindsættelseslinjer i T1-generationen, markant fremskynde avlsprocessen.

3.3Analyse af transgene ekspressionsniveauer

I funktionelle studier, brug stabile referencegener til normalisering for præcist at kvantificere transgentransskriptionsniveauer på tværs af forskellige transgene linjer.

3.4Påvisning af transgene komponenter

I diagnostiske indstillinger, referencegener tjener som interne positive kontroller til at overvåge DNA-ekstraktionskvalitet og PCR-effektivitet. Multiplex real-time PCR-metoder kan udvikles til samtidig at detektere måltransgener (f.eks., promotor, terminator, markør gener) og referencegenet, muliggør high-throughput analyse.

4. Projektovervejelser

For at sikre projektets succes og resultatpålidelighed, overholde følgende:

4.1 Medtag passende kontroller

Medtag altid positive kontroller (f.eks., plasmider med målsekvenser) og negative kontroller (ingen skabelonkontroller) i PCR-assays for at udelukke falske positive/negative.

4.2 Kontinuerlig optimering af referencegener

Intet referencegen er universelt perfekt. Genvalidér eller screen for det bedst egnede referencegen(s) under særlige eksperimentelle forhold.

4.3 Overholdelse af relevante standarder

Hvis forskningen involverer påvisning af genetisk modificerede komponenter, følge gældende national (f.eks., GB/T-serien) eller international (f.eks., ISO standarder) retningslinjer for at sikre overholdelse af procedurerne.

5. Projekt Workflow Resumé

En systematisk tilgang til et referencegenidentifikationsprojekt er som følger:

• Definer forskningsomfang: Afklar, om der er behov for et universelt referencegen eller et til specifikke forhold (f.eks., specifikt væv, stress).
• Vælg kandidatgener: Vælg et sæt kandidatgener baseret på litteratur og databasemining.
• Valider stabilitet: Eksperimentelt vurdere og identificere det mest stabilt udtrykte gen(s) ved hjælp af qPCR og bioinformatikværktøjer på tværs af et repræsentativt prøvesæt.
• Ansøg i forskning: Implementer det validerede referencegen(s) i praktiske transgene risforskningsapplikationer.

Leverandør

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.blev etableret i 2016 som er en professionel producent af biomagnetiske materialer og nukleinsyreekstraktionsreagenser.

Vi har stor erfaring med udvinding og oprensning af nukleinsyre, proteinoprensning, celleadskillelse, kemiluminescens, og andre tekniske områder.

Vores produkter er meget udbredt inden for mange områder, såsom medicinsk test, genetisk testning, universitetsforskning, genetisk avl, og så videre. Vi leverer ikke kun produkter, men kan også påtage os OEM, ODM, og andre behov. Hvis du har et relateret behov, er du velkommen til at kontakte os .