Hoe het interne referentiegen van transgene rijst te selecteren voor PCR-identificatie?

1. Selectiestrategie voor referentiegenen

De identificatie en screening van referentiegenen zijn van fundamenteel belang om de betrouwbaarheid van experimentele resultaten bij onderzoek naar transgene rijst te garanderen.

2.1Basisprincipes voor selectie

Ideale referentiegenen zouden stabiele expressie in verschillende weefsels moeten vertonen, organen, ontwikkelingsstadia, en experimentele omstandigheden. Een algemeen geaccepteerd criterium is een Cq-waarde (Kwantificeringscyclus) variatiebereik van minder dan 2.5.

2.2Voorafgaande screening met behulp van openbare databases

Maak gebruik van openbare databases zoals IC4R (Informatie Commons voor rijst) en RiceXRro (Database voor rijstexpressieprofielen) voor een eerste screening. Bio-informatica-analyse kan helpen bij het identificeren van kandidaatgenen met stabiele expressie onder verschillende omstandigheden.

2.3Evaluatie van traditionele en nieuwe genen

(1) Traditionele genen: Veelgebruikte referentiegenen omvatten OsSBE4, RbcS, Akte 1, en SPS (Sucrosefosfaatsynthase-gen).

(2) Nieuwe stabiele genen: Sommige onderzoeken bevelen nieuwere referentiegenen aan met aangetoonde stabiliteit, zoals UFC1 (Homoloog van UFM1-conjugerend enzym 1) en FhaB (Homoloog van Adhesine FhaB), die in specifieke contexten beter kunnen presteren dan traditionele.

2. Experimentele validatiestappen

Na het selecteren van kandidaat-referentiegenen, experimentele validatie is vereist, die voornamelijk de volgende stappen omvat:

2.1Bereiding van experimentele materialen

Verzamel een gevarieerde set rijstmonsters, die verschillende variëteiten vertegenwoordigen (bijv., japonica en indica), weefsels/organen (bijv., wortels, stengels, bladeren, helmknoppen, zaden), ontwikkelingsstadia, en behandelingsomstandigheden (bijv., biotische/abiotische stress). Voeg indien van toepassing specifieke transgene materialen toe.

2.2RNA-extractie en cDNA-synthese

Extraheer totaal RNA van hoge kwaliteit met behulp van betrouwbare kits en reverse transcriptie naar cDNA. Het is absoluut noodzakelijk om de zuiverheid en integriteit van RNA te controleren.

Gebruiken Totale RNA-extractiekit van Shanghai LNJNBio Plant(Magnetische kralenmethode) extraheer 20 mg verschillende soorten RNA van plantenbladeren，resultaat zoals hieronder weergegeven：

Het elektroferogram wordt hieronder weergegeven：

2.3 Primer- en sondeontwerp

Ontwerp primers en probes voor kwantitatieve real-time PCR (qPCR) gericht op de kandidaat-referentiegenen. Belangrijke overwegingen zijn onder meer:

• Primers moeten exon-exon-verbindingen overspannen om genomische DNA-amplificatie te voorkomen.
• De lengte van de amplicon moet idealiter tussen 80-200 bp.
• Gebruik de TaqMan-sondemethode wanneer een hogere specificiteit vereist is.

2.4qPCR-uitvoering en stabiliteitsbeoordeling

• Voer qPCR-amplificatie uit met behulp van SYBR Green- of TaqMan-chemie.
• Registreer en analyseer de Cq-waarden voor elk kandidaat-gen in alle monsters.
• Gebruik gespecialiseerde algoritmen (bijv., geNorm, Normzoeker, Beste Keeper) om de expressiestabiliteit te evalueren en het meest stabiele referentiegen te selecteren(S).

3. Toepassingen in transgeen onderzoek

Gevalideerde referentiegenen zijn cruciaal voor verschillende toepassingen in transgene rijststudies:

3.1Bepaling van het aantal transgene kopieën

Gebruik qPCR of digitale PCR (dPCR) met een referentiegen met één kopie als kalibrator om het kopieaantal van geïntegreerd T-DNA in het rijstgenoom kwantitatief te bepalen.

3.2Snelle screening van homozygote transgene lijnen

Gebruik qPCR-analyse waarbij referentie- en transgene signalen worden vergeleken (bijv., via de ΔΔCt-methode) om homozygote single-insertielijnen in de T1-generatie nauwkeurig te identificeren, waardoor het veredelingsproces aanzienlijk wordt versneld.

3.3Analyse van transgenexpressieniveaus

Bij functionele onderzoeken, gebruik stabiele referentiegenen voor normalisatie om transgene transcriptniveaus over verschillende transgene lijnen nauwkeurig te kwantificeren.

3.4Detectie van transgene componenten

In diagnostische instellingen, referentiegenen dienen als interne positieve controles om de kwaliteit van de DNA-extractie en de PCR-efficiëntie te controleren. Er kunnen multiplex real-time PCR-methoden worden ontwikkeld om tegelijkertijd doeltransgenen te detecteren (bijv., promotor, terminator, marker genen) en het referentiegen, waardoor analyse met hoge doorvoer mogelijk is.

4. Projectoverwegingen

Om het succes van het project en de betrouwbaarheid van de resultaten te garanderen, houd u aan het volgende:

4.1 Inclusief passende controles

Voeg altijd positieve controles toe (bijv., plasmiden met doelsequenties) en negatieve controles (besturingselementen zonder sjabloon) in PCR-testen om valse positieven/negatieven uit te sluiten.

4.2 Continue optimalisatie van referentiegenen

Geen enkel referentiegen is universeel perfect. Opnieuw valideren of screenen op het meest geschikte referentiegen(S) onder specifieke experimentele omstandigheden.

4.3 Naleving van relevante normen

Als het onderzoek de detectie van genetisch gemodificeerde componenten betreft, volg de toepasselijke nationale richtlijnen (bijv., GB/T-serie) of internationaal (bijv., ISO-normen) richtlijnen om de naleving van de procedures te garanderen.

5. Samenvatting van de projectworkflow

Een systematische aanpak voor een referentiegenidentificatieproject is als volgt:

• Onderzoeksreikwijdte definiëren: Verduidelijk of een universeel referentiegen nodig is of één voor specifieke omstandigheden (bijv., specifiek weefsel, spanning).
• Selecteer kandidaatgenen: Kies een reeks kandidaatgenen op basis van literatuur en databasemining.
• Valideer stabiliteit: Beoordeel en identificeer experimenteel het meest stabiel tot expressie gebrachte gen(S) met behulp van qPCR- en bio-informatica-instrumenten in een representatieve steekproefset.
• Toepassen in onderzoek: Implementeer het gevalideerde referentiegen(S) in praktische transgene rijstonderzoekstoepassingen.

Leverancier

Shanghai Lingjun Biotechnologie Co., Ltd.werd opgericht in 2016 dat een professionele fabrikant is van biomagnetische materialen en reagentia voor nucleïnezuurextractie.

We hebben een rijke ervaring in de extractie en zuivering van nucleïnezuren, eiwit zuivering, cel scheiding, chemiluminescentie, en andere technische gebieden.

Onze producten worden op veel gebieden veel gebruikt, zoals medische testen, genetische testen, universitair onderzoek, genetische veredeling, enzovoort. Wij leveren niet alleen producten, maar kunnen ook OEM ondernemen, ODM, en andere behoeften. Als u een gerelateerde behoefte heeft, Neem gerust contact met ons op .