PCR同定のための形質転換イネの内部参照遺伝子の選択方法?

1. 参照遺伝子の選択戦略

参照遺伝子の同定とスクリーニングは、トランスジェニックイネ研究における実験結果の信頼性を確保するための基礎です。.

2.1選定の基本原則

理想的な参照遺伝子は、さまざまな組織にわたって安定した発現を示す必要があります。, 臓器, 発達段階, および実験条件. 広く受け入れられている基準は Cq 値です (定量化サイクル) 未満の変動範囲 2.5.

2.2公開データベースを利用した事前審査

IC4Rなどの公開データベースを活用する (お米のインフォメーションコモンズ) とRiceXRro (イネ発現プロファイルデータベース) 一次審査用. バイオインフォマティクス分析は、さまざまな条件下で安定して発現する候補遺伝子の特定に役立ちます.

2.3伝統的遺伝子と新規遺伝子の評価

(1) 伝統的な遺伝子: 一般的に使用される参照遺伝子には OsSBE4 が含まれます, RbcS, 第一幕, およびSPS (ショ糖リン酸合成酵素遺伝子).

(2) 新規の安定遺伝子: 一部の研究では、安定性が実証された新しい参照遺伝子を推奨しています, UFC1など (UFM1結合酵素のホモログ 1) そしてFhaB (アドヘシン FhaB のホモログ), 特定の状況では従来のものよりも優れたパフォーマンスを発揮する可能性があります.

2. 実験的検証の手順

候補となる参照遺伝子を選択した後, 実験による検証が必要です, これには主に次の手順が含まれます:

2.1実験材料の準備

多様なお米のサンプルを集めます, さまざまな品種を代表する (例えば, ジャポニカとインディカ), 組織/器官 (例えば, ルーツ, 茎, 葉, 葯, 種子), 発達段階, そして治療条件 (例えば, 生物的/非生物的ストレス). 該当する場合、特定のトランスジェニック材料を含めます.

2.2RNA抽出とcDNA合成

信頼性の高いキットを使用して高品質のトータル RNA を抽出し、cDNA に逆転写します。. RNAの純度と完全性をチェックすることが不可欠です.

使用する 上海LNJNBioプラントトータルRNA抽出キット(磁気ビーズ法) さまざまな種類の植物の葉のRNAを20mg抽出，以下に示す結果：

エレクトロフェログラムを以下に示します：

2.3 プライマーとプローブの設計

定量的リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計する (qPCR) 候補参照遺伝子をターゲットにする. 主な考慮事項は次のとおりです。:

• ゲノム DNA の増幅を防ぐために、プライマーはエクソン-エクソン接合部にまたがる必要があります.
• アンプリコンの長さは、理想的には次の範囲内である必要があります。 80-200 血圧.
• より高い特異性が必要な場合は、TaqMan プローブ法を採用します。.

2.4qPCR の実行と安定性評価

• SYBR Green または TaqMan 化学を使用して qPCR 増幅を実行します.
• すべてのサンプルにわたる各候補遺伝子の Cq 値を記録して分析します.
• 特殊なアルゴリズムを利用する (例えば, ゲノルム, ノームファインダー, ベストキーパー) 発現の安定性を評価し、最も安定な参照遺伝子を選択する(s).

3. トランスジェニック研究への応用

検証された参照遺伝子は、トランスジェニックイネの研究におけるさまざまな応用に不可欠です:

3.1導入遺伝子のコピー数の決定

qPCR またはデジタル PCR を使用する (dPCR) イネのゲノムに組み込まれた T-DNA のコピー数を定量的に決定するためのキャリブレーターとして単一コピーの参照遺伝子を使用する.

3.2ホモ接合トランスジェニック系統の迅速スクリーニング

参照シグナルと導入遺伝子シグナルを比較する qPCR 分析を採用 (例えば, ΔΔCt法による) T1 世代のホモ接合単一挿入系統を正確に識別する, 繁殖プロセスを大幅に加速する.

3.3導入遺伝子発現レベルの分析

機能研究では, 安定した参照遺伝子を正規化に使用して、さまざまなトランスジェニック系統にわたるトランスジーン転写レベルを正確に定量します。.

3.4トランスジェニックコンポーネントの検出

診断設定で, 参照遺伝子は、DNA 抽出の品質と PCR 効率をモニタリングするための内部陽性コントロールとして機能します。. 標的導入遺伝子を同時に検出するマルチプレックスリアルタイム PCR 法を開発可能 (例えば, プロモーター, ターミネーター, マーカー遺伝子) そして参照遺伝子, ハイスループット分析を可能にする.

4. プロジェクトの考慮事項

プロジェクトの成功と結果の信頼性を確保するために, 以下を遵守してください:

4.1 適切なコントロールを含める

常にポジティブコントロールを含める (例えば, 標的配列を含むプラスミド) およびネガティブコントロール (テンプレートなしのコントロール) PCR アッセイで偽陽性/偽陰性を排除.

4.2 参照遺伝子の継続的な最適化

普遍的に完璧な参照遺伝子は存在しない. 最適な参照遺伝子を再検証またはスクリーニングします。(s) 特定の実験条件下で.

4.3 関連規格の遵守

研究に遺伝子組み換え成分の検出が含まれる場合, 該当する国に従う (例えば, GB/Tシリーズ) または国際的な (例えば, ISO規格) 手順の遵守を確保するためのガイドライン.

5. プロジェクトのワークフローの概要

参照遺伝子同定プロジェクトの体系的なアプローチは次のとおりです。:

• 研究範囲を定義する: 普遍的な参照遺伝子が必要なのか、それとも特定の条件に必要な参照遺伝子が必要なのかを明確にする (例えば, 特定の組織, ストレス).
• 候補遺伝子の選択: 文献とデータベースマイニングに基づいて候補遺伝子のセットを選択する.
• 安定性の検証: 最も安定して発現される遺伝子を実験的に評価して特定する(s) 代表的なサンプルセット全体でqPCRおよびバイオインフォマティクスツールを使用する.
• 研究に応募する: 検証済みの参照遺伝子を実装する(s) 実用的な遺伝子組み換えイネ研究への応用.

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上海霊軍生物技術有限公司, 株式会社に設立されました 2016 生体磁性材料と核酸抽出試薬の専門メーカーです.

核酸抽出・精製の経験が豊富です。, タンパク質の精製, 細胞分離, 化学発光, その他の技術分野.

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