Cara Memilih Gen Rujukan Dalaman Beras Transgenik untuk Pengecaman PCR?

1. Strategi Pemilihan untuk Gen Rujukan

Pengenalpastian dan penyaringan gen rujukan adalah asas untuk memastikan kebolehpercayaan keputusan eksperimen dalam penyelidikan beras transgenik.

2.1Prinsip Asas untuk Pemilihan

Gen rujukan yang ideal harus menunjukkan ekspresi yang stabil merentasi tisu yang berbeza, organ, peringkat perkembangan, dan keadaan eksperimen. Kriteria yang diterima secara meluas ialah nilai Cq (Kitaran Kuantifikasi) julat variasi kurang daripada 2.5.

2.2Saringan Awal Menggunakan Pangkalan Data Awam

Gunakan pangkalan data awam seperti IC4R (Maklumat Commons untuk Beras) dan RiceXRro (Pangkalan Data Profil Ungkapan Padi) untuk saringan awal. Analisis bioinformatik boleh membantu mengenal pasti gen calon dengan ekspresi yang stabil di bawah pelbagai keadaan.

2.3Penilaian Gen Tradisional dan Novel

(1) Gen Tradisional: Gen rujukan yang biasa digunakan termasuk OsSBE4, RbcS, Akta1, dan SPS (Gen Sucrose Phosphate Synthase).

(2) Novel Gen Stabil: Sesetengah kajian mengesyorkan gen rujukan yang lebih baru dengan kestabilan yang ditunjukkan, seperti UFC1 (Homolog UFM1-Conjugating Enzim 1) dan FhaB (Homolog Adhesin FhaB), yang mungkin mengatasi prestasi tradisional dalam konteks tertentu.

2. Langkah Pengesahan Eksperimen

Selepas memilih gen rujukan calon, pengesahan eksperimen diperlukan, yang terutamanya merangkumi langkah-langkah berikut:

2.1Penyediaan Bahan Eksperimen

Kumpulkan set sampel beras yang pelbagai, mewakili pelbagai jenis (cth., japonica dan indica), tisu/organ (cth., akar, batang, daun, anter, biji benih), peringkat perkembangan, dan keadaan rawatan (cth., tekanan biotik/abiotik). Sertakan bahan transgenik tertentu jika berkenaan.

2.2Pengekstrakan RNA dan Sintesis cDNA

Ekstrak jumlah RNA berkualiti tinggi menggunakan kit yang boleh dipercayai dan transkripsi balik ke dalam cDNA. Adalah penting untuk memeriksa ketulenan dan integriti RNA.

menggunakan Kit Pengekstrakan Jumlah RNA Loji LNJNBio Shanghai(Kaedah Manik Magnet) ekstrak 20mg pelbagai jenis daun tumbuhan RNA，hasil seperti ditunjukkan di bawah：

Elektroferogram ditunjukkan di bawah：

2.3 Reka Bentuk Primer dan Probe

Reka bentuk primer dan probe untuk PCR masa nyata kuantitatif (qPCR) menyasarkan gen rujukan calon. Pertimbangan utama termasuk:

• Primer harus merentangi simpang ekson-ekson untuk mengelakkan penguatan DNA genom.
• Panjang amplicon sepatutnya berada di antara 80-200 bp.
• Gunakan kaedah kuar TaqMan apabila kekhususan yang lebih tinggi diperlukan.

2.4Perlaksanaan qPCR dan Penilaian Kestabilan

• Lakukan penguatan qPCR menggunakan kimia SYBR Green atau TaqMan.
• Rekod dan analisis nilai Cq untuk setiap gen calon merentas semua sampel.
• Gunakan algoritma khusus (cth., geNorm, NormFinder, BestKeeper) untuk menilai kestabilan ekspresi dan memilih gen rujukan yang paling stabil(s).

3. Aplikasi dalam Penyelidikan Transgenik

Gen rujukan yang disahkan adalah penting untuk pelbagai aplikasi dalam kajian beras transgenik:

3.1Penentuan Nombor Salinan Transgene

Gunakan qPCR atau PCR digital (dPCR) dengan gen rujukan salinan tunggal sebagai penentukur untuk menentukan secara kuantitatif nombor salinan T-DNA bersepadu dalam genom beras.

3.2Pemeriksaan Pantas Garis Transgenik Homozigot

Gunakan analisis qPCR yang membandingkan rujukan dan isyarat transgen (cth., melalui kaedah ΔΔCt) untuk mengenal pasti garis sisipan tunggal homozigot dengan tepat dalam generasi T1, mempercepatkan proses pembiakan dengan ketara.

3.3Analisis Tahap Ekspresi Transgen

Dalam kajian fungsional, gunakan gen rujukan yang stabil untuk normalisasi untuk mengukur tahap transkrip transgen dengan tepat merentas garisan transgenik yang berbeza.

3.4Pengesanan Komponen Transgenik

Dalam tetapan diagnostik, gen rujukan berfungsi sebagai kawalan positif dalaman untuk memantau kualiti pengekstrakan DNA dan kecekapan PCR. Kaedah PCR masa nyata berganda boleh dibangunkan untuk mengesan transgen sasaran secara serentak (cth., promoter, terminator, gen penanda) dan gen rujukan, membolehkan analisis pemprosesan tinggi.

4. Pertimbangan Projek

Untuk memastikan kejayaan projek dan kebolehpercayaan hasil, mematuhi perkara berikut:

4.1 Sertakan Kawalan yang Sesuai

Sentiasa sertakan kawalan positif (cth., plasmid dengan jujukan sasaran) dan kawalan negatif (kawalan tanpa templat) dalam ujian PCR untuk menolak positif/negatif palsu.

4.2 Pengoptimuman Berterusan Gen Rujukan

Tiada gen rujukan yang sempurna secara universal. Sahkan semula atau skrin untuk gen rujukan yang paling sesuai(s) di bawah keadaan eksperimen tertentu.

4.3 Pematuhan kepada Piawaian Berkaitan

Sekiranya penyelidikan melibatkan pengesanan komponen yang diubah suai secara genetik, ikut kebangsaan yang berkenaan (cth., Siri GB/T) atau antarabangsa (cth., Piawaian ISO) garis panduan untuk memastikan pematuhan prosedur.

5. Ringkasan Aliran Kerja Projek

Pendekatan sistematik untuk projek pengenalan gen rujukan adalah seperti berikut:

• Tentukan Skop Penyelidikan: Jelaskan sama ada gen rujukan universal diperlukan atau satu untuk keadaan tertentu (cth., tisu tertentu, tekanan).
• Pilih Gen Calon: Pilih satu set gen calon berdasarkan literatur dan perlombongan pangkalan data.
• Sahkan Kestabilan: Menilai secara eksperimen dan mengenal pasti gen yang paling stabil dinyatakan(s) menggunakan qPCR dan alat bioinformatik merentas set sampel yang mewakili.
• Memohon dalam Penyelidikan: Laksanakan gen rujukan yang disahkan(s) dalam aplikasi penyelidikan beras transgenik praktikal.

Pembekal

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ditubuhkan pada 2016 yang merupakan pengilang profesional bahan biomagnet dan reagen pengekstrakan asid nukleik.

Kami mempunyai pengalaman yang kaya dalam pengekstrakan dan penulenan asid nukleik, penulenan protein, pemisahan sel, chemiluminescence, dan bidang teknikal yang lain.

Produk kami digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang, seperti ujian perubatan, ujian genetik, penyelidikan universiti, pembiakan genetik, dan seterusnya. Kami bukan sahaja menyediakan produk tetapi juga boleh menjalankan OEM, ODM, dan keperluan lain. Jika anda mempunyai keperluan yang berkaitan, sila hubungi kami .