Как выбрать внутренний эталонный ген трансгенного риса для ПЦР-идентификации?

1. Стратегия отбора эталонных генов

Идентификация и скрининг эталонных генов имеют основополагающее значение для обеспечения надежности экспериментальных результатов в исследованиях трансгенного риса..

2.1Основные принципы выбора

Идеальные эталонные гены должны демонстрировать стабильную экспрессию в различных тканях., органы, этапы развития, и условия эксперимента. Широко принятым критерием является значение Cq. (Количественный цикл) диапазон изменения менее 2.5.

2.2Предварительный отбор с использованием общедоступных баз данных

Используйте общедоступные базы данных, такие как IC4R. (Информация Commons для риса) и РайсXRro (База данных профилей экспрессии риса) для первичного скрининга. Биоинформатический анализ может помочь идентифицировать гены-кандидаты со стабильной экспрессией в различных условиях..

2.3Оценка традиционных и новых генов

(1) Традиционные гены: Часто используемые эталонные гены включают OsSBE4., РБСС, Акт 1, и СПС (Ген сахарозофосфатсинтазы).

(2) Новые стабильные гены: Некоторые исследования рекомендуют новые эталонные гены с продемонстрированной стабильностью., например UFC1 (Гомолог UFM1-конъюгирующего фермента 1) и ФХАБ (Гомолог адгезина FhaB), которые могут превзойти традиционные в конкретных контекстах.

2. Этапы экспериментальной проверки

После выбора эталонных генов-кандидатов, требуется экспериментальное подтверждение, который в первую очередь включает в себя следующие шаги:

2.1Подготовка экспериментальных материалов

Соберите разнообразный набор образцов риса., представляющие разные сорта (например, японская и индика), ткани/органы (например, корни, стебли, листья, пыльники, семена), этапы развития, и условия лечения (например, биотический/абиотический стресс). Включите конкретные трансгенные материалы, если применимо..

2.2Экстракция РНК и синтез кДНК

Извлекайте высококачественную тотальную РНК с помощью надежных наборов и выполняйте обратную транскрипцию в кДНК.. Обязательно необходимо проверить чистоту и целостность РНК..

С использованием Набор для экстракции тотальной РНК завода LNJNBio в Шанхае(Метод магнитных шариков) экстракт 20 мг РНК из листьев различных растений，результат, как показано ниже：

Электрофореграмма представлена ​​ниже：

2.3 Конструкция праймера и зонда

Разработка праймеров и зондов для количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) нацеливание на эталонные гены-кандидаты. Ключевые соображения включают в себя:

• Праймеры должны охватывать соединения экзон-экзон, чтобы предотвратить амплификацию геномной ДНК..
• Длина ампликона в идеале должна быть между 80-200 б.п..
• Используйте метод зонда TaqMan, когда требуется более высокая специфичность..

2.4Выполнение qPCR и оценка стабильности

• Выполните амплификацию qPCR с использованием химии SYBR Green или TaqMan..
• Запишите и проанализируйте значения Cq для каждого гена-кандидата во всех образцах..
• Используйте специализированные алгоритмы (например, геннорм, NormFinder, ЛучшийХранитель) оценить стабильность экспрессии и выбрать наиболее стабильный эталонный ген(с).

3. Применение в трансгенных исследованиях

Подтвержденные эталонные гены имеют решающее значение для различных применений в исследованиях трансгенного риса.:

3.1Определение количества копий трансгена

Используйте qPCR или цифровую ПЦР. (дПЦР) с использованием одной копии эталонного гена в качестве калибратора для количественного определения количества копий интегрированной Т-ДНК в геноме риса.

3.2Быстрый скрининг гомозиготных трансгенных линий

Используйте анализ qPCR, сравнивая эталонные и трансгенные сигналы. (например, методом ΔΔCt) для точной идентификации гомозиготных линий с одной вставкой в ​​поколении Т1, значительно ускоряя процесс размножения.

3.3Анализ уровней экспрессии трансгенов

В функциональных исследованиях, использовать стабильные эталонные гены для нормализации и точного количественного определения уровней трансгенных транскриптов в различных трансгенных линиях..

3.4Обнаружение трансгенных компонентов

В настройках диагностики, эталонные гены служат внутренним положительным контролем для контроля качества выделения ДНК и эффективности ПЦР.. Могут быть разработаны методы мультиплексной ПЦР в реальном времени для одновременного обнаружения целевых трансгенов. (например, промоутер, терминатор, маркерные гены) и эталонный ген, обеспечение высокопроизводительного анализа.

4. Соображения по проекту

Обеспечить успех проекта и надежность результатов, придерживаться следующего:

4.1 Включите соответствующие элементы управления

Всегда включайте положительный контроль (например, плазмиды с целевыми последовательностями) и отрицательный контроль (элементы управления без шаблонов) в ПЦР-анализах, чтобы исключить ложноположительные/отрицательные результаты.

4.2 Непрерывная оптимизация эталонных генов

Ни один референсный ген не является универсально совершенным.. Повторная проверка или поиск наиболее подходящего эталонного гена(с) в конкретных экспериментальных условиях.

4.3 Соблюдение соответствующих стандартов

Если исследование предполагает обнаружение генетически модифицированных компонентов, следовать применимым национальным (например, Серия ГБ/Т) или международный (например, стандарты ИСО) руководящие принципы, обеспечивающие соблюдение процедур.

5. Краткое описание рабочего процесса проекта

Системный подход к проекту идентификации эталонных генов заключается в следующем.:

• Определить объем исследования: Выясните, нужен ли универсальный эталонный ген или ген для конкретных условий. (например, специфическая ткань, стресс).
• Выберите гены-кандидаты: Выберите набор генов-кандидатов на основе литературы и анализа баз данных..
• Проверка стабильности: Экспериментально оценить и идентифицировать наиболее стабильно экспрессирующийся ген.(с) использование инструментов qPCR и биоинформатики в репрезентативном наборе образцов.
• Применить в исследованиях: Внедрить проверенный эталонный ген(с) в практических исследованиях трансгенного риса.

Поставщик

Шанхайская биотехнологическая компания Линцзюнь., ОООбыл создан в 2016 который является профессиональным производителем биомагнитных материалов и реагентов для экстракции нуклеиновых кислот..

Мы имеем богатый опыт в экстракции и очистке нуклеиновых кислот., очистка белка, разделение клеток, хемилюминесценция, и другие технические области.

Наша продукция широко используется во многих областях., например, медицинское тестирование, генетическое тестирование, университетские исследования, генетическое разведение, и так далее. Мы не только поставляем продукцию, но и можем взять на себя OEM, ОДМ, и другие потребности. Если у вас есть соответствующая потребность, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам .