Comment sélectionner le gène de référence interne du riz transgénique pour l'identification par PCR?

1. Stratégie de sélection des gènes de référence

L'identification et le criblage de gènes de référence sont fondamentaux pour garantir la fiabilité des résultats expérimentaux dans la recherche sur le riz transgénique..

2.1Principes de base de la sélection

Les gènes de référence idéaux devraient présenter une expression stable dans différents tissus, organes, étapes de développement, et conditions expérimentales. Un critère largement accepté est la valeur Cq (Cycle de quantification) plage de variation inférieure à 2.5.

2.2Sélection préliminaire à l'aide de bases de données publiques

Utiliser des bases de données publiques telles que IC4R (Communes d’informations sur le riz) et RiceXRro (Base de données de profils d'expression de riz) pour le dépistage initial. L'analyse bioinformatique peut aider à identifier les gènes candidats ayant une expression stable dans diverses conditions.

2.3Évaluation des gènes traditionnels et nouveaux

(1) Gènes traditionnels: Les gènes de référence couramment utilisés incluent OsSBE4, RbcS, Acte1, et SPS (Gène de saccharose phosphate synthase).

(2) Nouveaux gènes stables: Certaines études recommandent des gènes de référence plus récents avec une stabilité démontrée, comme UFC1 (Homologue de l'enzyme conjuguée UFM1 1) et FhaB (Homologue de l'Adhésine FhaB), qui peuvent surpasser les traditionnels dans des contextes spécifiques.

2. Étapes de validation expérimentale

Après avoir sélectionné les gènes de référence candidats, une validation expérimentale est requise, qui comprend principalement les étapes suivantes:

2.1Préparation du matériel expérimental

Recueillir un ensemble diversifié d'échantillons de riz, représentant différentes variétés (par ex., japonica et indica), tissus/organes (par ex., racines, tiges, feuilles, anthères, graines), étapes de développement, et conditions de traitement (par ex., stress biotique/abiotique). Inclure des matériaux transgéniques spécifiques, le cas échéant.

2.2Extraction d'ARN et synthèse d'ADNc

Extrayez un ARN total de haute qualité à l'aide de kits fiables et transcrivez-le de manière inverse en ADNc.. Il est impératif de vérifier la pureté et l’intégrité de l’ARN.

En utilisant Kit d'extraction d'ARN total de l'usine LNJNBio de Shanghai(Méthode des billes magnétiques) extraire 20 mg de différents types d'ARN de feuilles de plantes，résultat comme indiqué ci-dessous：

L'électrophérogramme est présenté ci-dessous：

2.3 Conception d'amorce et de sonde

Concevoir des amorces et des sondes pour la PCR quantitative en temps réel (qPCR) cibler les gènes de référence candidats. Les principales considérations comprennent:

• Les amorces doivent couvrir les jonctions exon-exon pour empêcher l’amplification de l’ADN génomique.
• La longueur de l'amplicon devrait idéalement être comprise entre 80-200 pb.
• Utiliser la méthode de sonde TaqMan lorsqu'une spécificité plus élevée est requise.

2.4Évaluation de l’exécution et de la stabilité de la qPCR

• Effectuer une amplification qPCR à l'aide de la chimie SYBR Green ou TaqMan.
• Enregistrez et analysez les valeurs Cq pour chaque gène candidat dans tous les échantillons.
• Utiliser des algorithmes spécialisés (par ex., geNorm, NormFinder, Meilleur gardien) pour évaluer la stabilité de l'expression et sélectionner le gène de référence le plus stable(s).

3. Applications en recherche transgénique

Les gènes de référence validés sont cruciaux pour diverses applications dans les études sur le riz transgénique:

3.1Détermination du numéro de copie du transgène

Utilisez la qPCR ou la PCR numérique (dPCR) avec un gène de référence à copie unique comme calibrateur pour déterminer quantitativement le nombre de copies de l'ADN-T intégré dans le génome du riz.

3.2Criblage rapide des lignées transgéniques homozygotes

Utiliser l’analyse qPCR comparant les signaux de référence et transgéniques (par ex., via la méthode ΔΔCt) identifier avec précision les lignées homozygotes à insertion unique dans la génération T1, accélérant considérablement le processus de sélection.

3.3Analyse des niveaux d'expression du transgène

Dans les études fonctionnelles, utiliser des gènes de référence stables pour la normalisation afin de quantifier avec précision les niveaux de transcription transgénique dans différentes lignées transgéniques.

3.4Détection des composants transgéniques

Dans les paramètres de diagnostic, les gènes de référence servent de contrôles positifs internes pour surveiller la qualité de l'extraction de l'ADN et l'efficacité de la PCR. Des méthodes PCR multiplexes en temps réel peuvent être développées pour détecter simultanément les transgènes cibles (par ex., promoteur, terminateur, gènes marqueurs) et le gène de référence, permettant une analyse à haut débit.

4. Considérations relatives au projet

Pour garantir la réussite du projet et la fiabilité des résultats, respecter ce qui suit:

4.1 Inclure des contrôles appropriés

Incluez toujours des contrôles positifs (par ex., plasmides avec séquences cibles) et contrôles négatifs (contrôles sans modèle) dans les tests PCR pour exclure les faux positifs/négatifs.

4.2 Optimisation continue des gènes de référence

Aucun gène de référence n’est universellement parfait. Revalider ou rechercher le gène de référence le plus approprié(s) dans des conditions expérimentales spécifiques.

4.3 Adhésion aux normes pertinentes

Si la recherche implique la détection de composants génétiquement modifiés, follow applicable national (par ex., GB/T series) or international (par ex., ISO standards) guidelines to ensure procedural compliance.

5. Project Workflow Summary

A systematic approach for a reference gene identification project is as follows:

• Define Research Scope: Clarify whether a universal reference gene is needed or one for specific conditions (par ex., specific tissue, stress).
• Select Candidate Genes: Choose a set of candidate genes based on literature and database mining.
• Validate Stability: Experimentally assess and identify the most stably expressed gene(s) using qPCR and bioinformatics tools across a representative sample set.
• Apply in Research: Implement the validated reference gene(s) in practical transgenic rice research applications.

Fournisseur

Société de biotechnologie Shanghai Lingjun., Ltd.a été établi en 2016 qui est un fabricant professionnel de matériaux biomagnétiques et de réactifs d'extraction d'acide nucléique.

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