Come selezionare il gene di riferimento interno del riso transgenico per l'identificazione tramite PCR?

1. Strategia di selezione per i geni di riferimento

L'identificazione e lo screening dei geni di riferimento sono fondamentali per garantire l'affidabilità dei risultati sperimentali nella ricerca sul riso transgenico.

2.1Principi di base per la selezione

I geni di riferimento ideali dovrebbero mostrare un'espressione stabile nei diversi tessuti, organi, fasi di sviluppo, e condizioni sperimentali. Un criterio ampiamente accettato è il valore Cq (Ciclo di quantificazione) intervallo di variazione inferiore a 2.5.

2.2Screening preliminare utilizzando database pubblici

Utilizza database pubblici come IC4R (Informazioni comuni sul riso) e RiceXRro (Database dei profili di espressione del riso) per lo screening iniziale. L'analisi bioinformatica può aiutare a identificare i geni candidati con espressione stabile in varie condizioni.

2.3Valutazione dei geni tradizionali e nuovi

(1) Geni tradizionali: I geni di riferimento comunemente usati includono OsSBE4, RbcS, Atto1, e SPS (Gene del saccarosio fosfato sintasi).

(2) Nuovi geni stabili: Alcuni studi raccomandano geni di riferimento più recenti con stabilità dimostrata, come UFC1 (Omologo dell'enzima coniugante UFM1 1) e FhaB (Omologo dell'adesina FhaB), che possono sovraperformare quelli tradizionali in contesti specifici.

2. Passaggi di convalida sperimentale

Dopo aver selezionato i geni di riferimento candidati, è necessaria la validazione sperimentale, che comprende principalmente i seguenti passaggi:

2.1Preparazione di materiali sperimentali

Raccogli una serie diversificata di campioni di riso, rappresentanti diverse varietà (per esempio., japonica e indica), tessuti/organi (per esempio., radici, steli, foglie, antere, semi), fasi di sviluppo, e condizioni di trattamento (per esempio., stress biotico/abiotico). Includere materiali transgenici specifici, se applicabile.

2.2Estrazione dell'RNA e sintesi del cDNA

Estrai RNA totale di alta qualità utilizzando kit affidabili e trascrivilo inversamente in cDNA. È fondamentale verificare la purezza e l'integrità dell'RNA.

Utilizzando Kit di estrazione dell'RNA totale dello stabilimento Shanghai LNJNBio(Metodo della perla magnetica) estrarre 20 mg di diversi tipi di RNA di foglie di piante，risultato come mostrato di seguito：

L'elettroferogramma è mostrato di seguito：

2.3 Progettazione di primer e sonde

Progetta primer e sonde per PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) mirando ai geni di riferimento candidati. Le considerazioni chiave includono:

• I primer dovrebbero estendersi sulle giunzioni esone-esone per prevenire l'amplificazione del DNA genomico.
• La lunghezza dell'amplicone dovrebbe idealmente essere compresa tra 80-200 p.b.
• Utilizzare il metodo della sonda TaqMan quando è richiesta una specificità più elevata.

2.4Esecuzione di qPCR e valutazione della stabilità

• Eseguire l'amplificazione qPCR utilizzando la chimica SYBR Green o TaqMan.
• Registrare e analizzare i valori Cq per ciascun gene candidato in tutti i campioni.
• Utilizzare algoritmi specializzati (per esempio., geNorm, NormFinder, BestKeeper) per valutare la stabilità dell'espressione e selezionare il gene di riferimento più stabile(S).

3. Applicazioni nella ricerca transgenica

I geni di riferimento convalidati sono cruciali per varie applicazioni negli studi sul riso transgenico:

3.1Determinazione del numero di copie del transgene

Utilizzare qPCR o PCR digitale (dPCR) con un gene di riferimento a copia singola come calibratore per determinare quantitativamente il numero di copie del T-DNA integrato nel genoma del riso.

3.2Screening rapido delle linee transgeniche omozigoti

Utilizzare l'analisi qPCR confrontando i segnali di riferimento e quelli transgenici (per esempio., tramite il metodo ΔΔCt) per identificare accuratamente le linee omozigoti a singola inserzione nella generazione T1, accelerando significativamente il processo di riproduzione.

3.3Analisi dei livelli di espressione del transgene

Negli studi funzionali, utilizzare geni di riferimento stabili per la normalizzazione per quantificare con precisione i livelli di trascrizione del transgene attraverso diverse linee transgeniche.

3.4Rilevazione di componenti transgenici

Nelle impostazioni diagnostiche, i geni di riferimento fungono da controlli positivi interni per monitorare la qualità dell'estrazione del DNA e l'efficienza della PCR. È possibile sviluppare metodi PCR multiplex in tempo reale per rilevare simultaneamente i transgeni target (per esempio., promotore, terminatore, geni marcatori) e il gene di riferimento, consentendo analisi ad alto rendimento.

4. Considerazioni sul progetto

Per garantire il successo del progetto e l’affidabilità dei risultati, attenersi a quanto segue:

4.1 Includere controlli appropriati

Includere sempre i controlli positivi (per esempio., plasmidi con sequenze bersaglio) e controlli negativi (controlli senza modello) nei test PCR per escludere falsi positivi/negativi.

4.2 Ottimizzazione continua dei geni di riferimento

Nessun gene di riferimento è universalmente perfetto. Riconvalidare o selezionare il gene di riferimento più adatto(S) in specifiche condizioni sperimentali.

4.3 Aderenza agli standard pertinenti

Se la ricerca prevede il rilevamento di componenti geneticamente modificati, seguire la normativa nazionale applicabile (per esempio., Serie GB/T) o internazionale (per esempio., Norme ISO) linee guida per garantire il rispetto delle procedure.

5. Riepilogo del flusso di lavoro del progetto

Un approccio sistematico per un progetto di identificazione del gene di riferimento è il seguente:

• Definire l'ambito della ricerca: Chiarire se è necessario un gene di riferimento universale o uno per condizioni specifiche (per esempio., tessuto specifico, stress).
• Seleziona i geni candidati: Scegli una serie di geni candidati in base alla letteratura e all'estrazione di database.
• Convalidare la stabilità: Valutare sperimentalmente e identificare il gene espresso più stabilmente(S) utilizzando qPCR e strumenti bioinformatici su un set di campioni rappresentativi.
• Applicare nella ricerca: Implementare il gene di riferimento convalidato(S) in applicazioni pratiche di ricerca sul riso transgenico.

Fornitore

Shanghai Lingjun Biotecnologia Co., Ltd.è stato fondato nel 2016 che è un produttore professionale di materiali biomagnetici e reagenti per l'estrazione degli acidi nucleici.

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