PCR 식별을 위한 형질전환 벼의 내부 참조 유전자를 선택하는 방법?

1. 참조 유전자 선택 전략

참조 유전자의 식별 및 스크리닝은 형질전환 벼 연구에서 실험 결과의 신뢰성을 보장하는 데 필수적입니다..

2.1선택의 기본 원칙

이상적인 참조 유전자는 다양한 조직에서 안정적인 발현을 보여야 합니다., 장기, 발달 단계, 및 실험 조건. 널리 인정되는 기준은 Cq 값입니다. (정량주기) 이하의 변동 범위 2.5.

2.2공공데이터베이스를 활용한 사전심사

IC4R 등 공공 데이터베이스 활용 (쌀 정보 공유) 그리고 RiceXRro (쌀 발현 프로필 데이터베이스) 초기 심사를 위해. 생물정보학 분석은 다양한 조건에서 안정적으로 발현되는 후보 유전자를 식별하는 데 도움을 줄 수 있습니다..

2.3전통적 유전자와 새로운 유전자의 평가

(1) 전통적 유전자: 일반적으로 사용되는 참조 유전자에는 OsSBE4가 포함됩니다., 적혈구, 1막, 그리고 SPS (자당 인산염 합성효소 유전자).

(2) 새로운 안정 유전자: 일부 연구에서는 안정성이 입증된 새로운 참조 유전자를 권장합니다., UFC1과 같은 (UFM1-접합 효소의 상동체 1) 그리고 FhaB (Adhesin FhaB의 동족체), 특정 상황에서는 기존 방식보다 성능이 뛰어날 수 있습니다..

2. 실험적 검증 단계

후보 참조 유전자 선정 후, 실험적 검증이 필요합니다, 여기에는 주로 다음 단계가 포함됩니다.:

2.1실험 재료 준비

다양한 쌀 샘플 수집, 다양한 품종을 대표하는 (예를 들어, 자포니카와 인디카), 조직/기관 (예를 들어, 뿌리, 줄기, 나뭇잎, 꽃밥, 씨앗), 발달 단계, 및 치료 조건 (예를 들어, 생물학적/비생물적 스트레스). 해당되는 경우 특정 형질전환 물질을 포함합니다..

2.2RNA 추출 및 cDNA 합성

신뢰할 수 있는 키트를 사용하여 고품질 total RNA를 추출하고 cDNA로 역전사합니다.. RNA 순도와 무결성을 확인하는 것이 필수적입니다..

사용 상하이 LNJNBio 공장 Total RNA 추출 키트(마그네틱 비드 방식) 다양한 종류의 식물 잎 RNA 20mg 추출，아래에 표시된 결과：

전기영동도는 아래와 같습니다.：

2.3 프라이머 및 프로브 디자인

정량적 실시간 PCR을 위한 프라이머 및 프로브 디자인 (qPCR) 후보 참조 유전자를 표적으로 삼는다. 주요 고려 사항은 다음과 같습니다:

• 프라이머는 게놈 DNA 증폭을 방지하기 위해 엑손-엑손 접합부에 걸쳐 있어야 합니다..
• 앰플리콘 길이는 이상적으로 다음 사이여야 합니다. 80-200 bp.
• 더 높은 특이성이 필요한 경우 TaqMan 프로브 방법을 사용하십시오..

2.4qPCR 실행 및 안정성 평가

• SYBR Green 또는 TaqMan 화학을 사용하여 qPCR 증폭 수행.
• 모든 샘플에서 각 후보 유전자의 Cq 값을 기록하고 분석합니다..
• 특화된 알고리즘 활용 (예를 들어, geNorm, NormFinder, 베스트키퍼) 발현 안정성을 평가하고 가장 안정적인 참조 유전자를 선택합니다.(에스).

3. 형질전환 연구에의 응용

검증된 참조 유전자는 형질전환 벼 연구의 다양한 응용에 매우 중요합니다.:

3.1이식유전자 카피 수의 결정

qPCR 또는 디지털 PCR 사용 (dPCR) 쌀 게놈에 통합된 T-DNA의 카피 수를 정량적으로 결정하기 위해 단일 카피 참조 유전자를 교정 도구로 사용합니다..

3.2동형접합성 형질전환 계통의 신속한 스크리닝

기준 신호와 이식유전자 신호를 비교하는 qPCR 분석 사용 (예를 들어, ΔΔCt 방법을 통해) T1 세대의 동형접합성 단일 삽입 계통을 정확하게 식별하기 위해, 번식 과정을 크게 가속화.

3.3이식유전자 발현 수준 분석

기능 연구에서, 다양한 트랜스제닉 계열에 걸쳐 트랜스진 전사체 수준을 정확하게 정량화하기 위해 정규화를 위한 안정적인 참조 유전자를 사용합니다..

3.4형질전환 성분의 검출

진단 설정에서, 참조 유전자는 DNA 추출 품질과 PCR 효율성을 모니터링하기 위한 내부 양성 대조군 역할을 합니다.. 다중 실시간 PCR 방법을 개발하여 표적 이식유전자를 동시에 검출할 수 있습니다. (예를 들어, 발기인, 터미네이터, 마커 유전자) 그리고 참조 유전자, 높은 처리량 분석 가능.

4. 프로젝트 고려 사항

프로젝트의 성공과 결과의 신뢰성을 보장하기 위해, 다음 사항을 준수하십시오:

4.1 적절한 컨트롤 포함

항상 긍정적인 통제를 포함하십시오 (예를 들어, 표적 서열을 갖는 플라스미드) 및 음성 대조군 (템플릿 없는 컨트롤) 위양성/음성을 배제하기 위한 PCR 분석.

4.2 참조 유전자의 지속적인 최적화

참조 유전자는 보편적으로 완벽하지 않습니다.. 가장 적합한 참조 유전자를 재검증하거나 선별합니다.(에스) 특정 실험 조건에서.

4.3 관련 표준 준수

연구에 유전자 변형 성분의 검출이 포함되는 경우, 해당 국가를 따르십시오. (예를 들어, GB/T 시리즈) 또는 국제 (예를 들어, ISO 표준) 절차 준수를 보장하기 위한 지침.

5. 프로젝트 작업 흐름 요약

참조 유전자 식별 프로젝트에 대한 체계적인 접근 방식은 다음과 같습니다.:

• 연구 범위 정의: 보편적 참조 유전자가 필요한지, 아니면 특정 조건에 필요한 유전자인지 명확히 합니다. (예를 들어, 특정 조직, 스트레스).
• 후보 유전자 선택: 문헌 및 데이터베이스 마이닝을 기반으로 후보 유전자 세트를 선택합니다..
• 안정성 검증: 가장 안정적으로 발현되는 유전자를 실험적으로 평가하고 식별합니다.(에스) 대표 샘플 세트 전반에 걸쳐 qPCR 및 생물정보학 도구 사용.
• 연구에 적용: 검증된 참조 유전자 구현(에스) 실제 형질전환 벼 연구에 적용.

공급자

상하이 링쥔 생명공학 유한회사, 주식회사에 설립되었습니다 2016 생체자성재료 및 핵산추출시약 전문제조업체입니다..

핵산 추출 및 정제 분야에서 풍부한 경험을 보유하고 있습니다., 단백질 정제, 세포 분리, 화학발광, 및 기타 기술 분야.

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