So wählen Sie das interne Referenzgen von transgenem Reis für die PCR-Identifizierung aus?

1. Auswahlstrategie für Referenzgene

Die Identifizierung und das Screening von Referenzgenen sind von grundlegender Bedeutung, um die Zuverlässigkeit experimenteller Ergebnisse in der Forschung an transgenem Reis sicherzustellen.

2.1Grundprinzipien für die Auswahl

Ideale Referenzgene sollten eine stabile Expression über verschiedene Gewebe hinweg aufweisen, Organe, Entwicklungsstadien, und experimentelle Bedingungen. Ein weithin akzeptiertes Kriterium ist ein Cq-Wert (Quantifizierungszyklus) Variationsbereich von weniger als 2.5.

2.2Vorläufiges Screening mithilfe öffentlicher Datenbanken

Nutzen Sie öffentliche Datenbanken wie IC4R (Information Commons für Reis) und RiceXRro (Rice Expression Profile-Datenbank) zum Erstscreening. Bioinformatische Analysen können dabei helfen, Kandidatengene mit stabiler Expression unter verschiedenen Bedingungen zu identifizieren.

2.3Bewertung traditioneller und neuartiger Gene

(1) Traditionelle Gene: Zu den häufig verwendeten Referenzgenen gehört OsSBE4, RbcS, Act1, und SPS (Saccharose-Phosphat-Synthase-Gen).

(2) Neuartige stabile Gene: Einige Studien empfehlen neuere Referenzgene mit nachgewiesener Stabilität, wie UFC1 (Homolog des UFM1-konjugierenden Enzyms 1) und FhaB (Homolog von Adhesin FhaB), die in bestimmten Kontexten die traditionellen übertreffen können.

2. Experimentelle Validierungsschritte

Nach Auswahl der Kandidaten-Referenzgene, Eine experimentelle Validierung ist erforderlich, Dies umfasst im Wesentlichen die folgenden Schritte:

2.1Vorbereitung experimenteller Materialien

Sammeln Sie verschiedene Reisproben, verschiedene Sorten darstellend (z.B., Japonica und Indica), Gewebe/Organe (z.B., Wurzeln, Stiele, Blätter, Staubbeutel, Samen), Entwicklungsstadien, und Behandlungsbedingungen (z.B., Biotischer/abiotischer Stress). Beziehen Sie ggf. spezifische transgene Materialien mit ein.

2.2RNA-Extraktion und cDNA-Synthese

Extrahieren Sie hochwertige Gesamt-RNA mit zuverlässigen Kits und transkribieren Sie sie revers in cDNA. Es ist unbedingt erforderlich, die Reinheit und Integrität der RNA zu überprüfen.

Benutzen Shanghai LNJNBio Plant Total RNA Extraction Kit(Magnetische Perlenmethode) Extrahieren Sie 20 mg verschiedene Arten von RNA aus Pflanzenblättern，Ergebnis wie unten gezeigt：

Das Elektropherogramm ist unten dargestellt：

2.3 Primer- und Sondendesign

Entwerfen Sie Primer und Sonden für die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) auf die Kandidaten-Referenzgene abzielen. Zu den wichtigsten Überlegungen gehören::

• Primer sollten Exon-Exon-Übergänge überspannen, um eine Amplifikation genomischer DNA zu verhindern.
• Die Länge des Amplifikats sollte idealerweise zwischen liegen 80-200 bp.
• Verwenden Sie die TaqMan-Sondenmethode, wenn eine höhere Spezifität erforderlich ist.

2.4qPCR-Ausführung und Stabilitätsbewertung

• Führen Sie eine qPCR-Amplifikation mit SYBR Green- oder TaqMan-Chemie durch.
• Erfassen und analysieren Sie die Cq-Werte für jedes Kandidatengen in allen Proben.
• Nutzen Sie spezielle Algorithmen (z.B., geNorm, NormFinder, BestKeeper) um die Expressionsstabilität zu bewerten und das stabilste Referenzgen auszuwählen(S).

3. Anwendungen in der transgenen Forschung

Validierte Referenzgene sind für verschiedene Anwendungen in transgenen Reisstudien von entscheidender Bedeutung:

3.1Bestimmung der Transgen-Kopienzahl

Verwenden Sie qPCR oder digitale PCR (dPCR) mit einem Einzelkopie-Referenzgen als Kalibrator zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl integrierter T-DNA im Reisgenom.

3.2Schnelles Screening homozygoter transgener Linien

Nutzen Sie die qPCR-Analyse zum Vergleich von Referenz- und Transgensignalen (z.B., über die ΔΔCt-Methode) zur genauen Identifizierung homozygoter Einzelinsertionslinien in der T1-Generation, Dadurch wird der Zuchtprozess erheblich beschleunigt.

3.3Analyse der Transgen-Expressionsniveaus

In funktionellen Studien, Verwenden Sie stabile Referenzgene zur Normalisierung, um die Transgen-Transkriptniveaus über verschiedene transgene Linien hinweg präzise zu quantifizieren.

3.4Nachweis transgener Komponenten

In den Diagnoseeinstellungen, Referenzgene dienen als interne Positivkontrollen zur Überwachung der DNA-Extraktionsqualität und PCR-Effizienz. Es können Multiplex-Echtzeit-PCR-Methoden entwickelt werden, um Zieltransgene gleichzeitig nachzuweisen (z.B., Promoter, Terminator, Markergene) und das Referenzgen, Ermöglicht Hochdurchsatzanalysen.

4. Projektüberlegungen

Um den Projekterfolg und die Ergebnissicherheit sicherzustellen, Halten Sie sich an Folgendes:

4.1 Integrieren Sie geeignete Kontrollen

Schließen Sie immer positive Kontrollen ein (z.B., Plasmide mit Zielsequenzen) und Negativkontrollen (No-Template-Steuerelemente) in PCR-Assays, um falsch positive/negative Ergebnisse auszuschließen.

4.2 Kontinuierliche Optimierung von Referenzgenen

Kein Referenzgen ist universell perfekt. Führen Sie eine erneute Validierung oder Suche nach dem am besten geeigneten Referenzgen durch(S) unter bestimmten experimentellen Bedingungen.

4.3 Einhaltung relevanter Standards

Wenn es sich bei der Forschung um den Nachweis gentechnisch veränderter Komponenten handelt, Befolgen Sie die geltenden nationalen Vorschriften (z.B., GB/T-Serie) oder international (z.B., ISO-Standards) Richtlinien zur Sicherstellung der Verfahrenskonformität.

5. Zusammenfassung des Projektablaufs

Ein systematischer Ansatz für ein Projekt zur Identifizierung von Referenzgenen ist wie folgt:

• Definieren Sie den Forschungsumfang: Klären Sie, ob ein universelles Referenzgen oder eines für bestimmte Erkrankungen benötigt wird (z.B., spezifisches Gewebe, Stress).
• Wählen Sie Kandidatengene aus: Wählen Sie eine Reihe von Kandidatengenen basierend auf Literatur- und Datenbankanalysen aus.
• Stabilität validieren: Bewerten und identifizieren Sie experimentell das am stabilsten exprimierte Gen(S) Verwendung von qPCR- und Bioinformatik-Tools für einen repräsentativen Probensatz.
• Bewerben Sie sich in der Forschung: Implementieren Sie das validierte Referenzgen(S) in praktischen Forschungsanwendungen für transgenen Reis.

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Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.wurde gegründet in 2016 Das ist ein professioneller Hersteller von biomagnetischen Materialien und Nukleinsäure-Extraktionsreagenzien.

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