Cara Memilih Gen Referensi Internal Beras Transgenik untuk Identifikasi PCR?

1. Strategi Seleksi Gen Referensi

Identifikasi dan penyaringan gen referensi merupakan hal mendasar untuk memastikan keandalan hasil eksperimen dalam penelitian padi transgenik.

2.1Prinsip Dasar Seleksi

Gen referensi yang ideal harus menunjukkan ekspresi yang stabil di berbagai jaringan, organ, tahapan perkembangan, dan kondisi percobaan. Kriteria yang diterima secara luas adalah nilai Cq (Siklus Kuantifikasi) rentang variasi kurang dari 2.5.

2.2Penyaringan Pendahuluan Menggunakan Database Publik

Memanfaatkan database publik seperti IC4R (Informasi Umum untuk Beras) dan RiceXRro (Database Profil Ekspresi Beras) untuk penyaringan awal. Analisis bioinformatika dapat membantu mengidentifikasi kandidat gen dengan ekspresi stabil dalam berbagai kondisi.

2.3Evaluasi Gen Tradisional dan Novel

(1) Gen Tradisional: Gen referensi yang umum digunakan termasuk OsSBE4, RbcS, Babak1, dan SPS (Gen Sintase Sukrosa Fosfat).

(2) Gen Stabil Baru: Beberapa penelitian merekomendasikan gen referensi baru yang menunjukkan stabilitas, seperti UFC1 (Homolog Enzim Konjugasi UFM1 1) dan FhaB (Homolog Adhesin FhaB), yang mungkin mengungguli yang tradisional dalam konteks tertentu.

2. Langkah Validasi Eksperimental

Setelah memilih kandidat gen referensi, validasi eksperimental diperlukan, yang terutama mencakup langkah-langkah berikut:

2.1Persiapan Bahan Percobaan

Kumpulkan beragam sampel beras, mewakili varietas yang berbeda (misalnya, japonica dan indica), jaringan/organ (misalnya, akar, batang, daun-daun, kepala sari, benih), tahapan perkembangan, dan kondisi pengobatan (misalnya, stres biotik/abiotik). Sertakan bahan transgenik tertentu jika ada.

2.2Ekstraksi RNA dan Sintesis cDNA

Ekstrak RNA total berkualitas tinggi menggunakan kit yang andal dan transkripsi balik menjadi cDNA. Sangat penting untuk memeriksa kemurnian dan integritas RNA.

Menggunakan Kit Ekstraksi RNA Total Pabrik LNJNBio Shanghai(Metode Manik Magnetik) ekstrak 20mg berbagai jenis RNA daun tanaman，hasilnya seperti gambar dibawah ini：

Elektroforogram ditunjukkan di bawah ini：

2.3 Desain Primer dan Probe

Rancang primer dan probe untuk PCR kuantitatif waktu nyata (qPCR) menargetkan gen referensi kandidat. Pertimbangan utama meliputi:

• Primer harus menjangkau persimpangan ekson-ekson untuk mencegah amplifikasi DNA genom.
• Panjang amplikon idealnya berada di antara keduanya 80-200 bp.
• Gunakan metode penyelidikan TaqMan ketika diperlukan spesifisitas yang lebih tinggi.

2.4qPenilaian Eksekusi dan Stabilitas PCR

• Lakukan amplifikasi qPCR menggunakan kimia SYBR Green atau TaqMan.
• Catat dan analisis nilai Cq untuk setiap kandidat gen di seluruh sampel.
• Gunakan algoritma khusus (misalnya, geNorm, Pencari Norma, Penjaga Terbaik) untuk mengevaluasi stabilitas ekspresi dan memilih gen referensi yang paling stabil(S).

3. Aplikasi dalam Penelitian Transgenik

Gen referensi yang tervalidasi sangat penting untuk berbagai aplikasi dalam penelitian padi transgenik:

3.1Penentuan Nomor Salinan Transgen

Gunakan qPCR atau PCR digital (dPCR) dengan gen referensi salinan tunggal sebagai kalibrator untuk menentukan secara kuantitatif jumlah salinan T-DNA terintegrasi dalam genom padi.

3.2Skrining Cepat Garis Transgenik Homozigot

Gunakan analisis qPCR yang membandingkan sinyal referensi dan transgen (misalnya, melalui metode ΔΔCt) untuk secara akurat mengidentifikasi garis penyisipan tunggal homozigot pada generasi T1, secara signifikan mempercepat proses pemuliaan.

3.3Analisis Tingkat Ekspresi Transgen

Dalam studi fungsional, menggunakan gen referensi yang stabil untuk normalisasi guna mengukur secara tepat tingkat transkrip transgen di berbagai jalur transgenik.

3.4Deteksi Komponen Transgenik

Dalam pengaturan diagnostik, gen referensi berfungsi sebagai kontrol positif internal untuk memantau kualitas ekstraksi DNA dan efisiensi PCR. Metode PCR real-time multipleks dapat dikembangkan untuk mendeteksi transgen target secara bersamaan (misalnya, promotor, terminator, gen penanda) dan gen referensi, memungkinkan analisis throughput tinggi.

4. Pertimbangan Proyek

Untuk memastikan keberhasilan proyek dan keandalan hasil, patuhi hal berikut ini:

4.1 Sertakan Kontrol yang Sesuai

Selalu sertakan kontrol positif (misalnya, plasmid dengan urutan target) dan kontrol negatif (kontrol tanpa templat) dalam tes PCR untuk menyingkirkan positif/negatif palsu.

4.2 Optimalisasi Gen Referensi yang Berkelanjutan

Tidak ada gen referensi yang sempurna secara universal. Validasi ulang atau saring gen referensi yang paling sesuai(S) dalam kondisi eksperimental tertentu.

4.3 Kepatuhan terhadap Standar yang Relevan

Jika penelitian melibatkan deteksi komponen hasil rekayasa genetika, mengikuti nasional yang berlaku (misalnya, Seri GB/T) atau internasional (misalnya, standar ISO) pedoman untuk memastikan kepatuhan prosedur.

5. Ringkasan Alur Kerja Proyek

Pendekatan sistematis untuk proyek identifikasi gen referensi adalah sebagai berikut:

• Tentukan Ruang Lingkup Penelitian: Perjelas apakah gen referensi universal diperlukan atau gen referensi untuk kondisi tertentu (misalnya, jaringan tertentu, menekankan).
• Pilih Gen Kandidat: Pilih satu set kandidat gen berdasarkan literatur dan penambangan basis data.
• Validasi Stabilitas: Nilai secara eksperimental dan identifikasi gen yang diekspresikan paling stabil(S) menggunakan qPCR dan alat bioinformatika di seluruh kumpulan sampel yang representatif.
• Terapkan dalam Penelitian: Menerapkan gen referensi yang divalidasi(S) dalam aplikasi penelitian padi transgenik praktis.

Pemasok

Shanghai Lingjun Bioteknologi Co., Ltd.didirikan pada 2016 yang merupakan produsen profesional bahan biomagnetik dan reagen ekstraksi asam nukleat.

Kami memiliki pengalaman yang kaya dalam ekstraksi dan pemurnian asam nukleat, pemurnian protein, pemisahan sel, kimialuminesensi, dan bidang teknis lainnya.

Produk kami banyak digunakan di berbagai bidang, misalnya tes kesehatan, pengujian genetik, penelitian universitas, pemuliaan genetik, dan sebagainya. Kami tidak hanya menyediakan produk tetapi juga dapat melakukan OEM, ODM, dan kebutuhan lainnya. Jika Anda memiliki kebutuhan terkait, jangan ragu untuk menghubungi kami .