На что следует обратить внимание при магнитно-шаровом методе выделения РНК крови?

Меры предосторожности для экстракции РНК крови на основе магнитных шариков

1. Сбор и обработка проб

1.1 Выбор антикоагулянта

Предпочтительный: ЭДТА，ингибирует кальций-зависимые нуклеазы.

Приемлемый: АКД

Избегать: Гепарин (блокирует последующие приложения)

1.2 График обработки

Обрабатывайте образцы сразу после сбора

Если задерживается:

Храните цельную кровь с антикоагулянтом при температуре 4°C в течение ≤24 часов.

Для длительного хранения: Заморозьте PBMC или лизат при температуре ≤-70°C.

1.3 Объем образца

Строго соблюдайте объемы, рекомендованные производителем.

1.4 Техника смешивания

Используйте осторожное пипетирование/перемешивание, чтобы предотвратить деградацию РНК.

1.5 Удаление эритроцитов

Обеспечить полный лизис эритроцитов и удаление остатков гемоглобина.

2. Фаза лизиса

2.1 Лизис клеток

Гомогенизируйте до тех пор, пока не останутся агрегаты клеток.

Соблюдайте указанное время/температуру инкубации.

2.2 Ингибирование РНКазы

Используйте свежий буфер для лизиса, содержащий денатуранты. (например, соли гуанидиния)

Храните образцы на льду во время обработки

2.3 РНК-носитель

Добавьте молекулы-носители (например, гликоген) для образцов с низким выходом, если указано

3. Обвязка и стирка магнитных бусин

3.1 Связывание шариков с нуклеиновыми кислотами

Критический шаг: Вортекс ≥30 секунд сразу после добавления шариков

Инкубируйте в течение точной продолжительности согласно протоколу.

3.2 Магнитная сепарация

Поместите пробирки в магнитный штатив на ≥2 мин, пока раствор не станет прозрачным.

Аспирируйте супернатант, не контактируя с гранулами.

3.3 Процедура стирки

Используйте свежеприготовленные промывочные буферы на основе этанола.

Стирать 1: Удаление солей и загрязнений

Стирать 2 (необязательный): Специальный буфер для повышения чистоты

Финальная стирка: Обеспечить полное удаление этанола (воздушно-сухие бусины 2-5 мин)

4. Фаза элюирования

4.1 Условия элюирования

Используйте воду, не содержащую нуклеаз, или буфер TE. (рН 8.0)

Инкубируйте при 55–65°C в течение 5 мин при периодическом перемешивании

4.2 Восстановление РНК

Выполните окончательную магнитную сепарацию

Перенесите супернатант в новую пробирку без РНКазы.

5. Контроль качества и хранение

5.1 Оценка чистоты

А<суб>260/280</суб>: 1.8–2,1

А<суб>260/230</суб>: >2.0

5.2 Проверка целостности

Электрофорез: Отдельные полосы 28S/18S рРНК (2:1 соотношение)

РИН (Номер целостности РНК): ≥7 для большинства приложений

5.3 Проверка загрязнения гДНК

Включите этап расщепления ДНКазой, если это необходимо для последующих анализов.

5.4 Хранилище

Аликвота РНК

Хранить при –80°C.; избегать >3 циклы замораживания-оттаивания

Критические напоминания

Пробирки с ЭДТА необходимы для ингибирования нуклеазы.

Немедленная обработка предотвращает деградацию РНК

Полное удаление этанола обязательно перед элюированием.

Среда, свободная от РНКазы: Перчатки, наконечники барьера, и обеззараженные поверхности

Проверка совместимости набора с типом образца (например, гепаринизированная кровь требует специальных наборов)

Поставщик

Шанхайская биотехнологическая компания Линцзюнь., ОООбыл создан в 2016 который является профессиональным производителем биомагнитных материалов и реагентов для экстракции нуклеиновых кислот..

Мы имеем богатый опыт в экстракции и очистке нуклеиновых кислот., очистка белка, разделение клеток, хемилюминесценция, и другие технические области.

Наша продукция широко используется во многих областях., например, медицинское тестирование, генетическое тестирование, университетские исследования, генетическое разведение, и так далее. Мы не только поставляем продукцию, но и можем взять на себя OEM, ОДМ, и другие потребности. Если у вас есть соответствующая потребность, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам .