O que deve ser prestado atenção no método de esfera magnética para extração de RNA sanguíneo?

Precauções para extração de RNA sanguíneo com base em esferas magnéticas

1. Coleta e Manuseio de Amostras

1.1 Seleção de Anticoagulantes

Preferido: EDTA，inibe nucleases dependentes de cálcio.

Aceitável: DAC

Evitar: Heparina (inibe aplicações downstream)

1.2 Cronograma de processamento

Processe amostras imediatamente após a coleta

Se atrasar:

Armazenar sangue total anticoagulado a 4°C por ≤24 h

Para armazenamento de longo prazo: Congelar PBMCs ou lisado a ≤-70°C

1.3 Volume de amostra

Siga rigorosamente os volumes recomendados pelo fabricante

1.4 Técnica de mistura

Use pipetagem/vortex suave para evitar a degradação do RNA

1.5 Remoção de eritrócitos

Garanta a lise completa de hemácias e a remoção de resíduos de hemoglobina

2. Fase de Lise

2.1 Lise Celular

Homogeneizar até que não restem agregados celulares

Respeite o tempo/temperatura de incubação especificado

2.2 Inibição de RNase

Use tampão de lise fresco contendo desnaturantes (por exemplo, sais de guanidínio)

Mantenha as amostras no gelo durante o processamento

2.3 RNA transportador

Adicione moléculas transportadoras (por exemplo, glicogênio) para amostras de baixo rendimento quando especificado

3. Encadernação e lavagem de contas magnéticas

3.1 Ligação de ácido nucléico

Etapa crítica: Vortex ≥30 segundos imediatamente após adicionar contas

Incubar pela duração exata por protocolo

3.2 Separação Magnética

Coloque os tubos em suporte magnético por ≥2 min até a solução clarear

Aspirar o sobrenadante sem entrar em contato com o grânulo

3.3 Procedimento de lavagem

Use tampões de lavagem à base de etanol recém-preparados

Lavar 1: Remova sais e contaminantes

Lavar 2 (opcional): Tampão específico do kit para aumento de pureza

Lavagem final: Garanta a remoção completa do etanol (contas secas ao ar 2-5 min)

4. Fase de Eluição

4.1 Condições de eluição

Use água livre de nuclease ou tampão TE (pH 8.0)

Incubar a 55–65°C durante 5 min com mistura periódica

4.2 Recuperação de RNA

Execute a separação magnética final

Transferir o sobrenadante para um novo tubo livre de RNase

5. Controle de Qualidade e Armazenamento

5.1 Avaliação de Pureza

UM_260/280: 1.8–2,1

UM_260/230: >2.0

5.2 Verificação de integridade

Eletroforese: Bandas distintas de rRNA 28S/18S (2:1 razão)

RIN (Número de integridade do RNA): ≥7 para a maioria das aplicações

5.3 Verificação de contaminação de gDNA

Incluir etapa de digestão de DNase, se necessário, para ensaios posteriores

5.4 Armazenar

Alíquota de RNA

Armazenar a –80°C; evitar >3 ciclos de congelamento e descongelamento

Lembretes críticos

Os tubos de EDTA são essenciais para a inibição da nuclease

O processamento imediato evita a degradação do RNA

A remoção completa do etanol é obrigatória antes da eluição

Ambiente livre de RNase: Luvas, dicas de barreira, e superfícies descontaminadas

Validar a compatibilidade do kit com o tipo de amostra (por exemplo, sangue heparinizado requer kits especializados)

Fornecedor

Xangai Lingjun Biotecnologia Co., Ltda.foi estabelecido em 2016 que é um fabricante profissional de materiais biomagnéticos e reagentes de extração de ácido nucleico.

Temos vasta experiência em extração e purificação de ácidos nucleicos, purificação de proteínas, separação celular, quimioluminescência, e outras áreas técnicas.

Nossos produtos são amplamente utilizados em muitos campos, como exames médicos, testes genéticos, pesquisa universitária, melhoramento genético, e assim por diante. Nós não apenas fornecemos produtos, mas também podemos realizar OEM, ODM, e outras necessidades. Se você tiver uma necessidade relacionada, não hesite em contactar-nos .