O que deve ser prestado atenção no método de esfera magnética para extração de RNA sanguíneo?

Precautions for Magnetic Bead-Based Blood RNA Extraction

1. Coleta e Manuseio de Amostras

1.1 Anticoagulant Selection

Preferred: EDTA，inibe nucleases dependentes de cálcio.

Aceitável: ACD

Avoid: Heparina (inibe aplicações downstream)

1.2 Processing Timeline

Process samples immediately after collection

If delayed:

Store anticoagulated whole blood at 4°C for ≤24 h

For long-term storage: Freeze PBMCs or lysate at ≤-70°C

1.3 Volume de amostra

Strictly follow manufacturer-recommended volumes

1.4 Mixing Technique

Use gentle pipetting/vortexing to prevent RNA degradation

1.5 Erythrocyte Removal

Ensure complete RBC lysis and removal of hemoglobin residues

2. Lysis Phase

2.1 Cell Lysis

Homogenize until no cell aggregates remain

Adhere to specified incubation time/temperature

2.2 RNase Inhibition

Use fresh lysis buffer containing denaturants (por exemplo, guanidinium salts)

Maintain samples on ice during processing

2.3 Carrier RNA

Add carrier molecules (por exemplo, glycogen) for low-yield samples when specified

3. Magnetic Bead Binding and Washing

3.1 Bead-Nucleic Acid Binding

Critical step: Vortex ≥30 sec immediately after adding beads

Incubate for exact duration per protocol

3.2 Magnetic Separation

Place tubes in magnetic stand for ≥2 min until solution clears

Aspirate supernatant without contacting bead pellet

3.3 Washing Procedure

Use freshly prepared ethanol-based wash buffers

Lavar 1: Remove salts and contaminants

Lavar 2 (optional): Kit-specific buffer for purity enhancement

Final wash: Ensure complete ethanol removal (air-dry beads 2-5 min)

4. Elution Phase

4.1 Condições de eluição

Use nuclease-free water or TE buffer (pH 8.0)

Incubate at 55–65°C for 5 min with periodic mixing

4.2 RNA Recovery

Perform final magnetic separation

Transfer supernatant to new RNase-free tube

5. Quality Control and Storage

5.1 Purity Assessment

UM_260/280: 1.8–2.1

UM_260/230: >2.0

5.2 Integrity Verification

Electrophoresis: Distinct 28S/18S rRNA bands (2:1 razão)

RIN (RNA Integrity Number): ≥7 for most applications

5.3 gDNA Contamination Check

Include DNase digestion step if required for downstream assays

5.4 Armazenar

Aliquot RNA

Store at –80°C; avoid >3 freeze-thaw cycles

Critical Reminders

EDTA tubes are essential for nuclease inhibition

Immediate processing prevents RNA degradation

Complete ethanol removal is mandatory before elution

RNase-free environment: Gloves, barrier tips, and decontaminated surfaces

Validate kit compatibility with sample type (por exemplo, heparinized blood requires specialized kits)

Fornecedor

Xangai Lingjun Biotecnologia Co., Ltda.foi estabelecido em 2016 que é um fabricante profissional de materiais biomagnéticos e reagentes de extração de ácido nucleico.

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