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रक्त आरएनए निष्कर्षण की चुंबकीय मनका विधि में किन बातों पर ध्यान देना चाहिए??
सावधानियां चुंबकीय मनका-आधारित रक्त आरएनए निष्कर्षण के लिए
1. नमूना संग्रह और हैंडलिंग
1.1 थक्कारोधी चयन
पसंदीदा: EDTA，कैल्शियम-निर्भर न्यूक्लिअस को रोकता है.
स्वीकार्य: एसीडी
टालना: हेपरिन (डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को रोकता है)
1.2 प्रसंस्करण समयरेखा
संग्रह के तुरंत बाद नमूने संसाधित करें
अगर देरी हुई:
एंटीकोआग्युलेटेड संपूर्ण रक्त को ≤24 घंटे के लिए 4°C पर संग्रहित करें
दीर्घकालिक भंडारण के लिए: पीबीएमसी को फ्रीज करें या ≤-70°C पर लाइसेट करें
1.3 नमूना मात्रा
निर्माता द्वारा अनुशंसित मात्राओं का सख्ती से पालन करें
1.4 मिश्रण तकनीक
आरएनए क्षरण को रोकने के लिए सौम्य पिपेटिंग/भंवर का प्रयोग करें
1.5 एरिथ्रोसाइट हटाना
पूर्ण आरबीसी विश्लेषण और हीमोग्लोबिन अवशेषों को हटाना सुनिश्चित करें
2. लाइसिस चरण
2.1 कोशिका अपघटन
जब तक कोई कोशिका समुच्चय न रह जाए तब तक समरूपीकरण करें
निर्दिष्ट ऊष्मायन समय/तापमान का पालन करें
2.2 RNase निषेध
डिनाट्यूरेंट्स युक्त ताज़ा लाइसिस बफर का उपयोग करें (जैसे, ग्वानिडिनियम लवण)
प्रसंस्करण के दौरान बर्फ पर नमूने बनाए रखें
2.3 वाहक आरएनए
वाहक अणु जोड़ें (जैसे, ग्लाइकोजन) निर्दिष्ट होने पर कम उपज वाले नमूनों के लिए
3. चुंबकीय मनका बंधन और धुलाई
3.1 मनका-न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग
महत्वपूर्ण कदम: मोती जोड़ने के तुरंत बाद भंवर ≥30 सेकंड
प्रति प्रोटोकॉल सटीक अवधि के लिए इनक्यूबेट करें
3.2 चुंबकीय पृथक्करण
समाधान साफ होने तक ट्यूबों को ≥2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड में रखें
मनका गोली से संपर्क किए बिना महाप्राण सतह पर तैरनेवाला
3.3 धोने की प्रक्रिया
ताज़ा तैयार इथेनॉल-आधारित वॉश बफ़र्स का उपयोग करें
धोना 1: लवण और संदूषक हटाएँ
धोना 2 (वैकल्पिक): शुद्धता बढ़ाने के लिए किट-विशिष्ट बफर
अंतिम धुलाई: पूर्ण इथेनॉल निष्कासन सुनिश्चित करें (हवा में सूखने वाले मोती 2-5 मिन)
4. निक्षालन चरण
4.1 निक्षालन की शर्तें
न्यूक्लिअस-मुक्त पानी या टीई बफर का उपयोग करें (पीएच 8.0)
55-65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें 5 आवधिक मिश्रण के साथ मिनट
4.2 आरएनए रिकवरी
अंतिम चुंबकीय पृथक्करण करें
सतह पर तैरनेवाला को नई RNase-मुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें
5. गुणवत्ता नियंत्रण और भंडारण
5.1 शुद्धता आकलन
ए<उप>260/280</उप>: 1.8-2.1
ए<उप>260/230</उप>: >2.0
5.2 सत्यनिष्ठा सत्यापन
वैद्युतकणसंचलन: विशिष्ट 28S/18S rRNA बैंड (2:1 अनुपात)
रिन (आरएनए इंटीग्रिटी नंबर): अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए ≥7
5.3 जीडीएनए संदूषण जांच
यदि डाउनस्ट्रीम परख के लिए आवश्यक हो तो DNase पाचन चरण को शामिल करें
5.4 भंडारण
एलिकोट आरएनए
-80°C पर स्टोर करें; टालना >3 फ्रीज-पिघलना चक्र
गंभीर अनुस्मारक
EDTA ट्यूब न्यूक्लीज निषेध के लिए आवश्यक हैं
तत्काल प्रसंस्करण आरएनए क्षरण को रोकता है
निक्षालन से पहले पूर्ण इथेनॉल निष्कासन अनिवार्य है
RNase मुक्त वातावरण: दस्ताने, बाधा युक्तियाँ, और विसंदूषित सतहें
नमूना प्रकार के साथ किट अनुकूलता सत्यापित करें (जैसे, हेपरिनाइज्ड रक्त के लिए विशेष किट की आवश्यकता होती है)
देने वाला
शंघाई लिंगजुन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेडमें स्थापित किया गया था 2016 जो बायोमैग्नेटिक सामग्रियों और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण अभिकर्मकों का एक पेशेवर निर्माता है.
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