A qué se debe prestar atención en el método de perlas magnéticas para la extracción de ARN en sangre?

Precauciones para la extracción de ARN sanguíneo a base de perlas magnéticas

1. Recogida y manipulación de muestras

1.1 Selección de anticoagulantes

Privilegiado: EDTA，inhibe las nucleasas dependientes de calcio.

Aceptable: ACD

Evitar: heparina (inhibe las aplicaciones posteriores)

1.2 Cronograma de procesamiento

Procese las muestras inmediatamente después de la recolección.

si se retrasa:

Almacenar sangre entera anticoagulada a 4°C durante ≤24 h.

Para almacenamiento a largo plazo: Congelar PBMC o lisar a ≤-70 °C

1.3 Volumen de muestra

Siga estrictamente los volúmenes recomendados por el fabricante.

1.4 Técnica de mezcla

Utilice una pipeta/agitación suave para evitar la degradación del ARN.

1.5 Eliminación de eritrocitos

Garantizar la lisis completa de los glóbulos rojos y la eliminación de los residuos de hemoglobina.

2. Fase de lisis

2.1 Lisis celular

Homogeneizar hasta que no queden agregados celulares.

Respete el tiempo/temperatura de incubación especificados.

2.2 Inhibición de la ARNasa

Utilice tampón de lisis nuevo que contenga desnaturalizantes. (p.ej., sales de guanidinio)

Mantener las muestras en hielo durante el procesamiento.

2.3 ARN portador

Agregar moléculas portadoras (p.ej., glucógeno) para muestras de bajo rendimiento cuando se especifica

3. Encuadernación y lavado de cuentas magnéticas

3.1 Unión de perlas y ácidos nucleicos

Paso crítico: Vortex ≥30 segundos inmediatamente después de agregar las perlas

Incubar durante la duración exacta según el protocolo.

3.2 Separación magnética

Coloque los tubos en un soporte magnético durante ≥2 minutos hasta que la solución se aclare.

Aspirar el sobrenadante sin entrar en contacto con el pellet de perlas.

3.3 Procedimiento de lavado

Utilice tampones de lavado a base de etanol recién preparados

Lavar 1: Eliminar sales y contaminantes.

Lavar 2 (opcional): Tampón específico del kit para mejorar la pureza

Lavado final: Garantizar la eliminación completa del etanol. (cuentas secas al aire 2-5 mín.)

4. Fase de elución

4.1 Condiciones de elución

Utilice agua libre de nucleasas o tampón TE (pH 8.0)

Incubar a 55–65°C durante 5 min con mezcla periódica

4.2 Recuperación de ARN

Realizar la separación magnética final.

Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNasa

5. Control de Calidad y Almacenamiento

5.1 Evaluación de pureza

A_260/280: 1.8–2.1

A_260/230: >2.0

5.2 Verificación de integridad

Electroforesis: Bandas distintas de ARNr 28S/18S (2:1 relación)

Rin (Número de integridad del ARN): ≥7 para la mayoría de las aplicaciones

5.3 Verificación de contaminación de ADNg

Incluya el paso de digestión con DNasa si es necesario para ensayos posteriores.

5.4 Almacenamiento

ARN alícuota

Conservar a –80°C; evitar >3 ciclos de congelación-descongelación

Recordatorios críticos

Los tubos de EDTA son esenciales para la inhibición de nucleasas

El procesamiento inmediato previene la degradación del ARN

La eliminación completa del etanol es obligatoria antes de la elución.

Entorno libre de RNasa: Guantes, consejos de barrera, y superficies descontaminadas

Validar la compatibilidad del kit con el tipo de muestra (p.ej., la sangre heparinizada requiere kits especializados)

Proveedor

Shanghai Lingjun Biotecnología Co., Limitado.se estableció en 2016 que es un fabricante profesional de materiales biomagnéticos y reactivos de extracción de ácidos nucleicos..

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