Bagaimana Membezakan DNA Plasmid daripada DNA Kromosom Semasa Pengekstrakan?

Pengekstrakan DNA plasmid adalah teknik asas dan penting dalam penyelidikan biologi molekul. Kunci untuk membezakan DNA plasmid daripada DNA kromosom terletak pada perbezaannya dalam sifat fizikal dan kimia.. Berikut adalah beberapa kaedah biasa untuk pembezaan.

1. Lisis Beralkali

Lisis alkali adalah salah satu kaedah yang paling banyak digunakan untuk pengekstrakan DNA plasmid. Prinsipnya adalah berdasarkan perbezaan struktur topologi antara DNA kromosom dan DNA plasmid. Dinding sel bakteria dan membran sel terganggu dalam persekitaran alkali yang kuat, melepaskan DNA kromosom dan DNA plasmid. Struktur heliks ganda DNA linear dimusnahkan dan didenaturasi, manakala DNA plasmid bulat tertutup secara kovalen, walaupun denaturasi di bawah alkali kuat(pH 12.6) syarat, masih mempunyai dua utas pelengkap yang saling berkait dan berkait rapat. Apabila pH 4.8 asetat kalium(atau natrium asetat) larutan penimbal garam tinggi ditambah untuk memulihkan neutraliti, DNA plasmid bulat tertutup secara kovalen berubah semula dengan cepat, manakala DNA kromosom linear berubah semula secara perlahan. Protein bakteria, dinding sel pecah, dan DNA kromosom yang terdenaturasi akan terjerat menjadi kompleks yang besar, yang diliputi oleh natrium dodesil sulfat(SDS). DNA plasmid boleh diperoleh semula daripada supernatan selepas sentrifugasi untuk mengeluarkan denaturan.

2. Lysis Mendidih

Lisis pendidihan amat sesuai untuk plasmid kecil yang kurang daripada 15 kb. Kaedah ini melibatkan penggantungan bakteria dalam penimbal yang mengandungi Triton X-100 dan lisozim yang boleh mencerna dinding sel., kemudian dipanaskan hingga 100°C untuk menyebabkan lisis. Pemanasan bukan sahaja memusnahkan dinding sel tetapi juga membantu mengikat pasangan asas untaian DNA dan denaturasi protein dan DNA kromosom.. DNA plasmid bulat tertutup tidak berpisah antara satu sama lain kerana tulang belakang fosfodiester mereka saling berkait dalam struktur topologi. Apabila suhu turun, pangkalan DNA bulat tertutup kembali ke kedudukannya, membentuk molekul bergelung super. DNA plasmid boleh dipulihkan daripada supernatan selepas sentrifugasi untuk membuang nukleoprotein kromosom ternyah.

3. Pengekstrakan Satu Langkah Persediaan Mini

Pengekstrakan satu langkah penyediaan mini adalah berdasarkan fakta bahawa DNA kromosom bakteria jauh lebih besar daripada DNA plasmid. DNA kromosom bakteria dicukur ke dalam saiz serpihan linear yang berbeza yang melekat pada serpihan sel dan menjadi denaturasi di bawah daya mekanikal. Walaupun DNA plasmid juga didenaturasi, ia menjadi semula dengan cepat selepas daya mekanikal hilang, kekal larut dalam larutan, manakala DNA kromosom bakteria berubah semula secara perlahan, membentuk struktur retikular yang tidak larut. DNA plasmid boleh dipisahkan dengan sentrifugasi berkelajuan tinggi.

4. Penggunaan Lajur Pemurnian

Lajur penulenan biasanya terdiri daripada lapisan membran silikon,  yang boleh menyerap DNA secara selektif, dan proses ini boleh diterbalikkan. Kumpulan silanol pada permukaan membran silikon menjadi bercas negatif selepas penceraian dalam larutan, membentuk jambatan elektrik dengan ion garam bercas positif dan DNA bercas negatif, seterusnya menyerap DNA. Membran silikon secara selektif menyerap DNA dalam keadaan pH rendah garam tinggi, dan membran silikon membebaskan DNA dalam keadaan pH tinggi garam rendah, .

5. Pengekstrakan asid nukleik dengan kaedah manik magnet

Molekul DNA mengikat molekul bercas positif (seperti kumpulan kimia bercas positif) pada permukaan manik magnet melalui tulang belakang fosfat yang bercas negatif melalui pengikatan elektrostatik pada pH tertentu, kepekatan garam, dan suhu. Ikatan ini khusus, memastikan hanya molekul DNA sasaran yang terikat pada manik magnet. Dalam beberapa kes, seperti bila PEG (polietilena glikol) dan ion garam ditambah, konformasi molekul DNA mengalami perubahan drastik. Keadaan linear dimampatkan menjadi keadaan sfera bergulung, yang menjadikan DNA lebih mudah untuk diikat dengan manik magnet. Pada masa yang sama, Molekul DNA dengan panjang yang berbeza mengalami pemendakan terpilih di bawah tindakan PEG dan ion garam, sekali gus mencapai pemisahan serpihan DNA dengan saiz yang berbeza.

Kaedah Manik Dwi Magnet: Ini adalah teknologi yang dibangunkan berdasarkan prinsip pengekstrakan plasmid, menggunakan dua jenis manik magnet dengan fungsi yang berbeza. Manik magnet I digunakan untuk membuang serpihan bakteria selepas lisis, manakala manik magnet II digunakan untuk pengasingan spesifik molekul asid nukleik. Di bawah tindakan penimbal lisis, SDS bergabung dengan serpihan bakteria, protein, dan kekotoran lain untuk membentuk kalium yang tidak larut (atau natrium) kompleks mendakan garam, yang mempunyai cas positif disebabkan oleh gabungan sejumlah besar K⁺ (atau Na⁺). Manik magnet I, dengan sebilangan besar manik magnet polikarboksilat bercas negatif, secara khusus boleh menyerap kekotoran melalui penjerapan elektrostatik dan koordinasi dengan K bercas positif⁺ (atau Na⁺) kompleks. Manik magnet II mempunyai permukaan yang diubah suai dengan kumpulan silanol yang banyak, yang secara khusus boleh menyerap asid nukleik dalam persekitaran pelarut alkohol, berdasarkan prinsip ini, pemisahan spesifik DNA plasmid boleh dicapai.

DNA plasmid boleh dipisahkan dengan berkesan daripada sel perumah dan ketulenan dan integritinya boleh dipastikan dengan kaedah di atas, meletakkan asas yang kukuh untuk eksperimen biologi molekul seterusnya.

Pembekal

Shanghai Lingjun Biotechnology Co., Ltd.ditubuhkan pada 2016 yang merupakan pengilang profesional bahan biomagnet dan reagen pengekstrakan asid nukleik.

Kami mempunyai pengalaman yang kaya dalam pengekstrakan dan penulenan asid nukleik, penulenan protein, pemisahan sel, chemiluminescence dan bidang teknikal lain.

Produk kami digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang, seperti ujian perubatan, ujian genetik, penyelidikan universiti, pembiakan genetik, dan seterusnya. Kami bukan sahaja menyediakan produk tetapi juga boleh menjalankan OEM, ODM, dan keperluan lain.Jika anda mempunyai keperluan yang berkaitan, sila hubungi kami disales01@lingjunbio.com.