Cómo distinguir el ADN plasmídico del ADN cromosómico durante la extracción?

Extracción de ADN plásmido Es una técnica fundamental e importante en la investigación de biología molecular.. La clave para distinguir el ADN plasmídico del ADN cromosómico radica en sus diferencias en las propiedades físicas y químicas.. Aquí hay varios métodos comunes para la diferenciación..

1. Lisis alcalina

La lisis alcalina es uno de los métodos más utilizados para la extracción de ADN plasmídico.. Su principio se basa en las diferencias en la estructura topológica entre el ADN cromosómico y el ADN plasmídico.. La pared celular y la membrana celular bacterianas se alteran en un ambiente alcalino fuerte., Liberación de ADN cromosómico y ADN plasmídico.. La estructura lineal de doble hélice del ADN se destruye y desnaturaliza, mientras que el ADN plasmídico circular cerrado covalentemente, aunque desnaturalizado bajo condiciones alcalinas fuertes(pH 12.6) condiciones, todavía tiene dos hilos complementarios que están entrelazados y estrechamente asociados. Cuando el pH es 4,8 acetato de potasio(o acetato de sodio) Se añade una solución tampón con alto contenido de sal para restaurar la neutralidad., El ADN del plásmido circular cerrado covalentemente se renaturaliza rápidamente, mientras que el ADN cromosómico lineal se renaturaliza lentamente. Proteínas bacterianas, paredes celulares rotas, y el ADN cromosómico desnaturalizado se entrelazará formando grandes complejos, que están cubiertos por dodecilsulfato de sodio(Ficha de datos de seguridad (MSDS)). El ADN plasmídico se puede recuperar del sobrenadante después de la centrifugación para eliminar el desnaturalizante..

2. Lisis en ebullición

La lisis por ebullición es particularmente adecuada para plásmidos pequeños de menos de 15 kb. Este método implica suspender bacterias en un tampón que contiene Triton X-100 y lisozima que puede digerir la pared celular., luego calentar a 100°C para causar lisis. El calentamiento no sólo destruye la pared celular sino que también ayuda a desenredar el emparejamiento de bases de las cadenas de ADN y a desnaturalizar las proteínas y el ADN cromosómico.. El ADN plasmídico circular cerrado no se separa entre sí porque sus cadenas principales de fosfodiéster están entrelazadas en una estructura topológica.. Cuando la temperatura baja, las bases del ADN circular cerrado regresan a sus posiciones, formando una molécula superenrollada. El ADN plásmido se puede recuperar del sobrenadante después de la centrifugación para eliminar las nucleoproteínas cromosómicas desnaturalizadas..

3. Extracción en un solo paso con minipreparación

La extracción en un solo paso con minipreparación se basa en el hecho de que el ADN cromosómico bacteriano es mucho más grande que el ADN plasmídico.. El ADN cromosómico bacteriano se corta en fragmentos lineales de diferentes tamaños que se adhieren a los restos celulares y se desnaturalizan bajo fuerza mecánica.. Aunque el ADN plasmídico también se desnaturaliza, Se renaturaliza rápidamente después de que desaparece la fuerza mecánica., permanece soluble en la solución, mientras que el ADN cromosómico bacteriano se renaturaliza lentamente, formando una estructura reticular insoluble. El ADN plasmídico se puede separar mediante centrifugación a alta velocidad.

4. Aplicación de columnas de purificación

Las columnas de purificación generalmente están compuestas por una capa de membrana de silicona.,  que puede adsorber selectivamente el ADN., y este proceso es reversible. Los grupos silanol en la superficie de la membrana de silicona se cargan negativamente después de la disociación en la solución., Formando un puente eléctrico con iones de sal cargados positivamente y ADN cargado negativamente., adsorbiendo así el ADN. La membrana de silicona adsorbe selectivamente el ADN en condiciones de alto contenido de sal y bajo pH., y la membrana de silicona libera ADN en condiciones de bajo contenido de sal y alto pH, .

5. Extracción de ácidos nucleicos mediante el método de perlas magnéticas.

Las moléculas de ADN se unen a las moléculas cargadas positivamente. (como grupos químicos cargados positivamente) en la superficie de cuentas magnéticas a través de sus cadenas principales de fosfato cargadas negativamente mediante unión electrostática a un pH específico, concentración de sal, y temperatura. Esta unión es específica., asegurar que solo las moléculas de ADN objetivo se unan a las perlas magnéticas. En algunos casos, como cuando CLAVIJA (polietilenglicol) y se añaden iones de sal, La conformación de las moléculas de ADN sufre cambios drásticos.. El estado lineal se comprime en un estado esférico rizado., lo que hace que el ADN sea más fácil de unir con perlas magnéticas. Al mismo tiempo, Las moléculas de ADN de diferentes longitudes se precipitan selectivamente bajo la acción de PEG y iones de sal., logrando así la separación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños.

Método de cuentas magnéticas duales: Esta es una tecnología desarrollada en base al principio de extracción de plásmidos., usando dos tipos de cuentas magnéticas con diferentes funciones. La perla magnética I se utiliza para eliminar restos bacterianos después de la lisis., mientras que la perla magnética II se utiliza para la separación específica de moléculas de ácido nucleico. Bajo la acción del tampón de lisis., SDS se combina con restos bacterianos, proteínas, y otras impurezas para formar potasio insoluble. (o sodio) complejo de precipitado de sal, que tiene una carga positiva debido a la combinación de una gran cantidad de K⁺ (o na⁺). Cuenta magnética I, con una gran cantidad de perlas magnéticas de policarboxilato cargadas negativamente, Puede adsorber específicamente impurezas mediante adsorción electrostática y coordinación con el K cargado positivamente.⁺ (o na⁺) complejo. La perla magnética II tiene una superficie modificada con abundantes grupos silanol., que puede adsorber específicamente ácidos nucleicos en un entorno de disolvente alcohólico, basado en este principio, Se puede lograr la separación específica del ADN plasmídico..

El ADN plasmídico se puede separar eficazmente de las células huésped y su pureza e integridad se pueden garantizar mediante los métodos anteriores., Sentar una base sólida para experimentos posteriores de biología molecular..

Proveedor

Shanghai Lingjun Biotecnología Co., Limitado.se estableció en 2016 que es un fabricante profesional de materiales biomagnéticos y reactivos de extracción de ácidos nucleicos..

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