Come distinguere il DNA plasmidico dal DNA cromosomico durante l'estrazione?

Estrazione del DNA plasmidico è una tecnica fondamentale e importante nella ricerca di biologia molecolare. La chiave per distinguere il DNA plasmidico dal DNA cromosomico risiede nelle loro differenze nelle proprietà fisiche e chimiche. Ecco diversi metodi comuni per la differenziazione.

1. Lisi alcalina

La lisi alcalina è uno dei metodi più utilizzati per l’estrazione del DNA plasmidico. Il suo principio si basa sulle differenze nella struttura topologica tra il DNA cromosomico e il DNA plasmidico. La parete cellulare batterica e la membrana cellulare vengono disgregate in un ambiente fortemente alcalino, rilasciando DNA cromosomico e DNA plasmidico. La struttura lineare a doppia elica del DNA viene distrutta e denaturata, mentre il DNA plasmidico circolare chiuso covalentemente, anche se denaturato sotto forte alcalinità(pH 12.6) condizioni, ha ancora due filoni complementari che sono intrecciati e strettamente associati. Quando pH 4,8 acetato di potassio(o acetato di sodio) viene aggiunta una soluzione tampone ad alto contenuto di sale per ripristinare la neutralità, Il DNA plasmidico circolare covalentemente chiuso si rinatura rapidamente, mentre il DNA cromosomico lineare si rinatura lentamente. Proteine ​​batteriche, pareti cellulari rotte, e il DNA cromosomico denaturato si impiglierà in grandi complessi, che sono ricoperti da sodio dodecil solfato(Scheda di sicurezza). Il DNA plasmidico può essere recuperato dal surnatante dopo la centrifugazione per rimuovere il denaturante.

2. Lisi bollente

La lisi bollente è particolarmente adatta per piccoli plasmidi di dimensioni inferiori 15 kb. Questo metodo prevede la sospensione dei batteri in un tampone contenente Triton X-100 e lisozima in grado di digerire la parete cellulare, quindi riscaldare a 100°C per provocare la lisi. Il riscaldamento non solo distrugge la parete cellulare, ma aiuta anche a districare l’appaiamento delle basi del filamento di DNA e a denaturare le proteine ​​e il DNA cromosomico.. Il DNA plasmidico circolare chiuso non si separa l'uno dall'altro perché le loro dorsali fosfodiestere sono intrecciate in una struttura topologica. Quando la temperatura scende, le basi del DNA circolare chiuso ritornano nelle loro posizioni, formando una molecola superavvolta. Il DNA plasmidico può essere recuperato dal surnatante dopo la centrifugazione per rimuovere le nucleoproteine ​​cromosomiche denaturate.

3. Estrazione in un unico passaggio Mini-Prep

L'estrazione one-step mini-prep si basa sul fatto che il DNA cromosomico batterico è molto più grande del DNA plasmidico. Il DNA cromosomico batterico viene tagliato in frammenti lineari di diverse dimensioni che aderiscono ai detriti cellulari e si denaturano sotto la forza meccanica. Sebbene anche il DNA plasmidico sia denaturato, si rinatura rapidamente dopo che la forza meccanica scompare, rimanendo solubile nella soluzione, mentre il DNA cromosomico batterico si rinatura lentamente, formando una struttura reticolare insolubile. Il DNA plasmidico può essere separato mediante centrifugazione ad alta velocità.

4. Applicazione delle colonne di purificazione

Le colonne di purificazione sono generalmente composte da uno strato di membrana siliconica,  che possono adsorbire selettivamente il DNA, e questo processo è reversibile. I gruppi silanolici sulla superficie della membrana siliconica si caricano negativamente dopo la dissociazione nella soluzione, formando un ponte elettrico con ioni salini caricati positivamente e DNA caricato negativamente, assorbendo così il DNA. La membrana in silicone adsorbe selettivamente il DNA in condizioni di alto contenuto di sale e basso pH, e la membrana in silicone rilascia DNA in condizioni di pH elevato e basso contenuto di sale, .

5. Estrazione dell'acido nucleico mediante metodo delle biglie magnetiche

Le molecole di DNA si legano alle molecole caricate positivamente (come i gruppi chimici carichi positivamente) sulla superficie di perline magnetiche attraverso le loro dorsali fosfatiche caricate negativamente tramite legame elettrostatico a pH specifico, concentrazione di sale, e temperatura. Questo legame è specifico, assicurando che solo le molecole di DNA bersaglio si leghino alle sfere magnetiche. In alcuni casi, come quando PEG (polietilenglicole) e vengono aggiunti ioni sale, la conformazione delle molecole di DNA subisce cambiamenti drastici. Lo stato lineare è compresso in uno stato sferico arricciato, che rende il DNA più facile da legare con le sfere magnetiche. Allo stesso tempo, Le molecole di DNA di diversa lunghezza subiscono una precipitazione selettiva sotto l'azione di PEG e ioni salini, ottenendo così la separazione di frammenti di DNA di diverse dimensioni.

Metodo a doppia perla magnetica: Si tratta di una tecnologia sviluppata sulla base del principio dell'estrazione del plasmide, utilizzando due tipi di sfere magnetiche con funzioni diverse. La perla magnetica I viene utilizzata per rimuovere i detriti batterici dopo la lisi, mentre la perla magnetica II viene utilizzata per la separazione specifica delle molecole di acido nucleico. Sotto l'azione del tampone di lisi, L'SDS si combina con i detriti batterici, proteine, e altre impurità per formare un potassio insolubile (o sodio) complesso di precipitato salino, che ha una carica positiva dovuta alla combinazione di una grande quantità di K⁺ (o Na⁺). Perlina magnetica I, con un gran numero di sfere magnetiche di policarbossilato caricate negativamente, può assorbire specificamente le impurità attraverso l'adsorbimento elettrostatico e la coordinazione con il K caricato positivamente⁺ (o Na⁺) complesso. La perla magnetica II ha una superficie modificata con abbondanti gruppi silanolici, che può adsorbire specificamente gli acidi nucleici in un ambiente solvente alcolico, sulla base di questo principio, è possibile ottenere la separazione specifica del DNA plasmidico.

Il DNA plasmidico può essere efficacemente separato dalle cellule ospiti e la sua purezza e integrità possono essere garantite mediante i metodi di cui sopra, gettando solide basi per successivi esperimenti di biologia molecolare.

Fornitore

Shanghai Lingjun Biotecnologia Co., Ltd.è stato fondato nel 2016 che è un produttore professionale di materiali biomagnetici e reagenti per l'estrazione degli acidi nucleici.

Abbiamo una ricca esperienza nell'estrazione e purificazione degli acidi nucleici, purificazione delle proteine, separazione cellulare, chemiluminescenza e altri campi tecnici.

I nostri prodotti sono ampiamente utilizzati in molti campi, come i test medici, test genetici, ricerca universitaria, allevamento genetico, e così via. Non solo forniamo prodotti, ma possiamo anche intraprendere l'OEM, ODM, e altre esigenze. Se hai un'esigenza correlata, non esitate a contattarci asales01@lingjunbio.com.