Strategie e metodi di base per la de-endotossina durante la purificazione del DNA plasmidico

L'uso di plasmidi esenti da endotossine dovrebbe essere preso in considerazione quando il DNA plasmidico estratto viene utilizzato per la trasfezione del DNA primario, sospensione, o cellule sensibili, studi sul silenziamento genico, micromanipolazione per iniezione cellulare, terapia genica o vaccini a DNA,e altri esperimenti estremamente impegnativi.

La de-endotossina del plasmide si riferisce alla fase di rimozione dell'endotossina (lipopolisaccaride, LPS) durante la purificazione del DNA plasmidico. L'endotossina è un lipopolisaccaride e un complesso proteico presente nella parete cellulare dei batteri Gram-negativi che viene rilasciato durante la lisi dei batteri. La presenza di endotossina influisce notevolmente sull'efficienza della trasfezione e può attivare reazioni non specifiche delle cellule immunitarie, con conseguente falso positivo nell'esperimento. Perciò, al fine di garantire un elevato tasso di trasfezione e un'elevata sopravvivenza delle cellule trasfettate, l'endotossina deve essere rimossa dal processo di preparazione del plasmide.

L'importanza della rimozione delle endotossine è:

1.Influisce sull'efficienza della trasfezione: l'endotossina ridurrà l'efficienza di trasfezione delle cellule primarie e delle cellule in coltura sensibili, e interferiscono con la trasfezione in vitro delle cellule immunitarie.

2.Attiva la risposta immunitaria: l'endotossina può anche portare alla febbre, ipotensione, difficoltà respiratoria, coagulazione intravascolare, e sindrome da shock endotossico, l'endotossina può stimolare la sintesi dei fattori infiammatori IL-1, IL-6, IL-10, e TNF-α attivando TLR4.

3,.Requisiti normativi sui farmaci: La State Drug Administration stabilisce che il contenuto di endotossina nei prodotti vaccinali a DNA non deve essere superiore a 0.01 UE/μg, e la dose per uso personale non deve superare 20 Unione Europea.

Esistono due strategie per la rimozione delle endotossine:

1. Rimozione in fase di rilegatura: l'endotossina viene rimossa nella fase di legame del DNA plasmidico.

2. Rimozione dopo l'eluizione: rimuovere l'endotossina dopo l'eluizione del DNA plasmidico.

Gli attuali metodi di rimozione delle endotossine includono principalmente:

1. Rimozione non selettiva: come l'assorbimento, ultrafiltrazione, e cromatografia di esclusione.

2. Precipitazioni selettive: per esempio., utilizzando la polimixina B, istidine, e cromatografia di affinità con poli-L-lisina.

3. Cromatografia di interazione idrofobica e cromatografia a scambio ionico.

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