Estratégias e métodos básicos para desendotoxina durante a purificação do DNA plasmidial

O uso de plasmídeos livres de endotoxinas deve ser considerado quando o DNA plasmídico extraído é usado para transfecção de, suspensão, ou células sensíveis, estudos de silenciamento genético, micromanipulação de injeção celular, terapia genética ou vacinas de DNA,e outras experiências extremamente exigentes.

A desendotoxina do plasmídeo refere-se à etapa de remoção da endotoxina (lipopolissacarídeo, LPS) durante a purificação do DNA plasmídico. A endotoxina é um complexo de lipopolissacarídeos e proteínas na parede celular de bactérias Gram-negativas que é liberado quando a bactéria lisa.. A presença de endotoxina afeta grandemente a eficiência da transfecção e pode ativar reações inespecíficas de células imunes, resultando em falsos positivos no experimento. Portanto, a fim de garantir uma alta taxa de transfecção e alta sobrevivência de células transfectadas, a endotoxina deve ser removida do processo de preparação do plasmídeo.

A importância da remoção de endotoxinas é:

1.Afetar a eficiência da transfecção: a endotoxina reduzirá a eficiência de transfecção de células primárias e células cultivadas sensíveis, e interferir na transfecção in vitro de células imunes.

2.Ativar resposta imunológica: endotoxina também pode causar febre, hipotensão, dificuldade respiratória, coagulação intravascular, e síndrome do choque endotóxico, endotoxina pode estimular a síntese de fatores inflamatórios IL-1, IL-6, IL-10, e TNF-α ativando TLR4.

3,.Requisitos regulatórios de medicamentos: A Administração Estatal de Medicamentos estipula que o conteúdo de endotoxina em vacinas de DNA não deve ser superior a 0.01 EU/μg, e a dose para uso pessoal não deve exceder 20 UE.

Existem duas estratégias para remoção de endotoxinas:

1. Remoção na fase de vinculação: a endotoxina é removida no estágio de ligação ao DNA do plasmídeo.

2. Remoção após eluição: remover endotoxina após eluição do DNA plasmídico.

Os métodos atuais de remoção de endotoxinas incluem principalmente:

1. Remoção não seletiva: como adsorção, ultrafiltração, e cromatografia de exclusão.

2. Precipitação seletiva: por exemplo, usando polimixina B, histidinas, e cromatografia de afinidade de poli-L-lisina.

3. Cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de troca iônica.

Nosso kit de extração de DNA plasmídico sem endotoxinas (método de conta magnética) adota uma fórmula de solução única que requer apenas algumas lavagens simples para remover a endotoxina, proteínas, polissacarídeos, e outras impurezas, e então obtém DNA plasmídico de alta qualidade. Este produto extrai e purifica o DNA plasmídico com poucos danos aos plasmídeos, alta concentração de extração, e uma alta proporção de super-hélice. O DNA plasmídico extraído pode ser usado para digestão, PCR, sequenciamento, ligadura,n e transformação.

Fornecedor

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