प्लास्मिड डीएनए शुद्धि के दौरान डी-एंडोटॉक्सिनाइजेशन के लिए बुनियादी रणनीतियाँ और विधियाँ

एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लास्मिड का उपयोग जब निकाले गए प्लास्मिड डीएनए का उपयोग प्राथमिक के ट्रांसफ़ेक्शन के लिए किया जाता है तो इस पर विचार किया जाना चाहिए, निलंबन, या संवेदनशील कोशिकाएं, जीन साइलेंसिंग अध्ययन, सेल इंजेक्शन माइक्रोमैनिपुलेशन, जीन थेरेपी या डीएनए टीके,और अन्य अत्यंत मांग वाले प्रयोग.

प्लास्मिड डी-एंडोटॉक्सिनाइजेशन एंडोटॉक्सिन को हटाने के चरण को संदर्भित करता है (lipopolysaccharide, एलपीएस) प्लास्मिड डीएनए के शुद्धिकरण के दौरान. एंडोटॉक्सिन ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया की कोशिका दीवार में एक लिपोपॉलीसेकेराइड और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो बैक्टीरिया के नष्ट होने पर निकलता है।. एंडोटॉक्सिन की उपस्थिति ट्रांसफ़ेक्शन दक्षता को बहुत प्रभावित करती है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को सक्रिय कर सकती है, प्रयोग में गलत सकारात्मक परिणाम सामने आए. इसलिए, उच्च अभिकर्मक दर और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की उच्च उत्तरजीविता सुनिश्चित करने के लिए, प्लास्मिड तैयार करने की प्रक्रिया से एंडोटॉक्सिन को हटाया जाना चाहिए.

एंडोटॉक्सिन निष्कासन का महत्व है:

1.अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित करें: एंडोटॉक्सिन प्राथमिक कोशिकाओं और संवेदनशील सुसंस्कृत कोशिकाओं की अभिकर्मक दक्षता को कम कर देगा, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के इन विट्रो ट्रांसफ़ेक्शन में हस्तक्षेप करते हैं.

2.प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सक्रिय करें: एंडोटॉक्सिन से बुखार भी हो सकता है, अल्प रक्त-चाप, श्वसन संकट, इंट्रावस्कुलर जमावट, और एंडोटॉक्सिक शॉक सिंड्रोम, एंडोटॉक्सिन सूजन संबंधी कारकों IL-1 के संश्लेषण को उत्तेजित कर सकता है, आईएल-6, आईएल 10, और TLR4 को सक्रिय करके TNF-α.

3,.औषधि विनियामक आवश्यकताएँ: राज्य औषधि प्रशासन का कहना है कि डीएनए वैक्सीन उत्पादों में एंडोटॉक्सिन की मात्रा इससे अधिक नहीं होनी चाहिए 0.01 ईयू/μg, और व्यक्तिगत उपयोग के लिए खुराक से अधिक नहीं होनी चाहिए 20 यूरोपीय संघ.

एंडोटॉक्सिन हटाने के लिए दो रणनीतियाँ हैं:

1. बाइंडिंग स्टेज पर हटाना: प्लास्मिड डीएनए बाइंडिंग चरण में एंडोटॉक्सिन को हटा दिया जाता है.

2. निक्षालन के बाद हटाना: प्लास्मिड डीएनए निक्षालन के बाद एंडोटॉक्सिन हटा दें.

वर्तमान एंडोटॉक्सिन हटाने के तरीकों में मुख्य रूप से शामिल हैं:

1. गैर-चयनात्मक निष्कासन: जैसे सोखना, अल्ट्राफिल्ट्रेशन, और बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी.

2. चयनात्मक वर्षा: जैसे, पॉलीमीक्सिन बी का उपयोग करना, हिस्टिडीन, और पॉली-एल-लाइसिन एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी.

3. हाइड्रोफोबिक इंटरेक्शन क्रोमैटोग्राफी और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी.

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