निष्कर्षण के दौरान प्लास्मिड डीएनए को क्रोमोसोमल डीएनए से कैसे अलग करें?

प्लाज्मिड डीएनए निष्कर्षण आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में एक मौलिक और महत्वपूर्ण तकनीक है. क्रोमोसोमल डीएनए से प्लास्मिड डीएनए को अलग करने की कुंजी भौतिक और रासायनिक गुणों में उनके अंतर में निहित है. यहां विभेदीकरण के लिए कई सामान्य तरीके दिए गए हैं.

1. क्षारीय लसीका

प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण के लिए क्षारीय लसीका सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधियों में से एक है. इसका सिद्धांत क्रोमोसोमल डीएनए और प्लास्मिड डीएनए के बीच टोपोलॉजिकल संरचना में अंतर पर आधारित है. तीव्र क्षारीय वातावरण में जीवाणु कोशिका भित्ति और कोशिका झिल्ली बाधित हो जाती है, क्रोमोसोमल डीएनए और प्लास्मिड डीएनए जारी करना. रैखिक डीएनए डबल हेलिक्स संरचना नष्ट और विकृत हो जाती है, जबकि सहसंयोजक रूप से बंद गोलाकार प्लास्मिड डीएनए, हालांकि मजबूत क्षारीय के तहत विकृत(पीएच 12.6) स्थितियाँ, अभी भी दो पूरक सूत्र हैं जो आपस में गुंथे हुए हैं और निकटता से जुड़े हुए हैं. जब pH 4.8 एसीटेट पोटैशियम हो(या सोडियम एसीटेट) तटस्थता बहाल करने के लिए उच्च-नमक बफर समाधान जोड़ा जाता है, सहसंयोजक रूप से बंद गोलाकार प्लास्मिड डीएनए तेजी से पुनर्निर्मित होता है, जबकि रैखिक गुणसूत्र डीएनए धीरे-धीरे पुनर्निर्मित होता है. जीवाणु प्रोटीन, कोशिका भित्ति का टूटना, और विकृत क्रोमोसोमल डीएनए बड़े परिसरों में उलझ जाएगा, जो सोडियम डोडेसिल सल्फेट से ढके होते हैं(एसडीएस). विकृतीकरण को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्लास्मिड डीएनए को सतह पर तैरनेवाला से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है.

2. उबलता हुआ लसीका

इससे कम क्षमता वाले छोटे प्लास्मिड के लिए उबलना लिसी विशेष रूप से उपयुक्त है 15 केबी. इस विधि में ट्राइटन एक्स-100 और लाइसोजाइम युक्त बफर में बैक्टीरिया को निलंबित करना शामिल है जो कोशिका दीवार को पचा सकता है, फिर लसीका पैदा करने के लिए 100°C तक गर्म किया जाता है. गर्म करने से न केवल कोशिका भित्ति नष्ट हो जाती है, बल्कि डीएनए स्ट्रैंड बेस पेयरिंग को सुलझाने और प्रोटीन और क्रोमोसोमल डीएनए को विकृत करने में भी मदद मिलती है।. बंद गोलाकार प्लास्मिड डीएनए एक दूसरे से अलग नहीं होते हैं क्योंकि उनकी फॉस्फोडिएस्टर रीढ़ एक टोपोलॉजिकल संरचना में आपस में जुड़ी होती हैं. जब तापमान गिरता है, बंद वृत्ताकार डीएनए के आधार अपनी स्थिति पर लौट आते हैं, एक सुपरकुंडलित अणु का निर्माण. विकृत क्रोमोसोमल न्यूक्लियोप्रोटीन को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्लास्मिड डीएनए को सतह पर तैरनेवाला से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है.

3. मिनी-प्रेप वन-स्टेप एक्सट्रैक्शन

मिनी-प्रीप वन-स्टेप निष्कर्षण इस तथ्य पर आधारित है कि बैक्टीरियल क्रोमोसोमल डीएनए प्लास्मिड डीएनए से बहुत बड़ा है. बैक्टीरियल क्रोमोसोमल डीएनए को विभिन्न आकार के रैखिक टुकड़ों में विभाजित किया जाता है जो कोशिका मलबे से चिपक जाते हैं और यांत्रिक बल के तहत विकृत हो जाते हैं. हालाँकि प्लास्मिड डीएनए भी विकृत होता है, यांत्रिक बल लुप्त हो जाने के बाद यह शीघ्रता से पुनः रूप धारण कर लेता है, घोल में घुलनशील रहता है, जबकि बैक्टीरिया क्रोमोसोमल डीएनए धीरे-धीरे पुनर्निर्मित होता है, एक अघुलनशील जालीदार संरचना का निर्माण. प्लास्मिड डीएनए को उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जा सकता है.

4. शुद्धिकरण स्तंभों का अनुप्रयोग

शुद्धिकरण स्तंभ आम तौर पर सिलिकॉन झिल्ली की एक परत से बने होते हैं,  जो डीएनए को चुनिंदा रूप से सोख सकता है, और यह प्रक्रिया प्रतिवर्ती है. समाधान में पृथक्करण के बाद सिलिकॉन झिल्ली की सतह पर सिलेनॉल समूह नकारात्मक रूप से चार्ज हो जाते हैं, सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए नमक आयनों और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए डीएनए के साथ एक विद्युत पुल बनाना, जिससे डीएनए अवशोषित हो जाता है. सिलिकॉन झिल्ली उच्च-नमक कम-पीएच स्थितियों के तहत डीएनए को चुनिंदा रूप से सोख लेती है, और सिलिकॉन झिल्ली कम नमक उच्च पीएच स्थितियों के तहत डीएनए जारी करती है, .

5. चुंबकीय मोतियों की विधि द्वारा न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण

डीएनए अणु धनावेशित अणुओं से बंधते हैं (जैसे धनात्मक आवेशित रासायनिक समूह) की सतह पर चुंबकीय मोती विशिष्ट पीएच पर इलेक्ट्रोस्टैटिक बाइंडिंग के माध्यम से उनके नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए फॉस्फेट बैकबोन के माध्यम से, नमक की सघनता, और तापमान. यह बंधन विशिष्ट है, यह सुनिश्चित करना कि केवल लक्ष्य डीएनए अणु ही चुंबकीय मोतियों से बंधे हों. कुछ मामलों में, जैसे कि कब खूंटी (पॉलीथीन ग्लाइकोल) और नमक आयन मिलाए जाते हैं, डीएनए अणुओं की संरचना में भारी परिवर्तन होता है. रैखिक अवस्था को एक घुमावदार गोलाकार अवस्था में संपीड़ित किया जाता है, जिससे डीएनए को चुंबकीय मोतियों से बांधना आसान हो जाता है. एक ही समय पर, विभिन्न लंबाई के डीएनए अणु पीईजी और नमक आयनों की कार्रवाई के तहत चयनात्मक अवक्षेपण से गुजरते हैं, इस प्रकार विभिन्न आकारों के डीएनए टुकड़ों को अलग करना संभव हो सका.

दोहरी चुंबकीय मनका विधि: यह प्लास्मिड निष्कर्षण के सिद्धांत पर विकसित एक तकनीक है, विभिन्न कार्यों के साथ दो प्रकार के चुंबकीय मोतियों का उपयोग करना. चुंबकीय मनका I का उपयोग विश्लेषण के बाद बैक्टीरिया के मलबे को हटाने के लिए किया जाता है, जबकि चुंबकीय मनका II का उपयोग न्यूक्लिक एसिड अणुओं के विशिष्ट पृथक्करण के लिए किया जाता है. लसीका बफर की कार्रवाई के तहत, एसडीएस बैक्टीरिया के मलबे के साथ जुड़ जाता है, प्रोटीन, और अन्य अशुद्धियाँ अघुलनशील पोटेशियम बनाती हैं (या सोडियम) नमक अवक्षेप जटिल, जिसमें K की बड़ी मात्रा के संयोजन के कारण धनात्मक आवेश होता है⁺ (या ना⁺). चुंबकीय मनका I, बड़ी संख्या में नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पॉलीकार्बोक्सिलेट चुंबकीय मोतियों के साथ, इलेक्ट्रोस्टैटिक सोखना और सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए K के साथ समन्वय के माध्यम से विशेष रूप से अशुद्धियों को सोख सकता है⁺ (या ना⁺) जटिल. चुंबकीय मनका II की सतह प्रचुर मात्रा में सिलेनॉल समूहों के साथ संशोधित है, जो अल्कोहल विलायक वातावरण में विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड को सोख सकता है, इस सिद्धांत पर आधारित, प्लास्मिड डीएनए का विशिष्ट पृथक्करण प्राप्त किया जा सकता है.

प्लास्मिड डीएनए को मेजबान कोशिकाओं से प्रभावी ढंग से अलग किया जा सकता है और उपरोक्त तरीकों से इसकी शुद्धता और अखंडता सुनिश्चित की जा सकती है, बाद के आणविक जीवविज्ञान प्रयोगों के लिए एक ठोस आधार तैयार करना.

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