Как отличить плазмидную ДНК от хромосомной ДНК во время экстракции?

Экстракция плазмидной ДНК является фундаментальным и важным методом исследований в области молекулярной биологии.. Ключ к отличию плазмидной ДНК от хромосомной ДНК лежит в их различиях в физических и химических свойствах.. Вот несколько распространенных методов дифференциации.

1. Щелочной лизис

Щелочной лизис — один из наиболее широко используемых методов выделения плазмидной ДНК.. Его принцип основан на различиях топологической структуры хромосомной ДНК и плазмидной ДНК.. Бактериальная клеточная стенка и клеточная мембрана разрушаются в сильнощелочной среде., высвобождение хромосомной ДНК и плазмидной ДНК. Линейная структура двойной спирали ДНК разрушается и денатурируется., в то время как ковалентно замкнутая кольцевая плазмидная ДНК, хотя денатурируется в условиях сильной щелочи(рН 12.6) условия, все еще имеет две дополняющие друг друга цепи, которые переплетаются и тесно связаны. При рН 4,8 ацетат калия(или ацетат натрия) для восстановления нейтральности добавляется буферный раствор с высоким содержанием соли., covalently closed circular plasmid DNA renatures quickly, while linear chromosomal DNA renatures slowly. Bacterial proteins, ruptured cell walls, and denatured chromosomal DNA will entangle into large complexes, which are covered by sodium dodecyl sulfate(Паспорт безопасности). Plasmid DNA can be recovered from the supernatant after centrifugation to remove the denaturant.

2. Boiling Lysis

Boiling lysis is particularly suitable for small plasmids of less than 15 КБ. This method involves suspending bacteria in a buffer containing Triton X-100 and lysozyme that can digest the cell wall, then heating to 100°C to cause lysis. Heating not only destroys the cell wall but also helps tountangle DNA strand base pairing and denature proteins and chromosomal DNA. Замкнутая кольцевая плазмидная ДНК не отделяется друг от друга, поскольку их фосфодиэфирные остовы переплетены в топологической структуре.. Когда температура падает, основания замкнутой кольцевой ДНК возвращаются на свои позиции, образуя сверхспиральную молекулу. Плазмидную ДНК можно извлечь из супернатанта после центрифугирования для удаления денатурированных хромосомных нуклеопротеинов..

3. Одноэтапная экстракция Mini-Prep

Одноэтапная экстракция мини-препа основана на том факте, что бактериальная хромосомная ДНК намного больше, чем плазмидная ДНК.. Бактериальная хромосомная ДНК разрезается на линейные фрагменты разного размера, которые прилипают к клеточным остаткам и денатурируются под действием механического воздействия.. Хотя плазмидная ДНК также денатурирована., он быстро восстанавливается после исчезновения механической силы, остающийся растворимым в растворе, в то время как бактериальная хромосомная ДНК медленно ренатурирует, образуя нерастворимую ретикулярную структуру. Плазмидную ДНК можно отделить высокоскоростным центрифугированием..

4. Применение колонн очистки

Колонны очистки обычно состоят из слоя силиконовой мембраны.,  который может избирательно адсорбировать ДНК, и этот процесс обратим. Силанольные группы на поверхности силиконовой мембраны после диссоциации в растворе приобретают отрицательный заряд., образуя электрический мостик с положительно заряженными ионами соли и отрицательно заряженной ДНК, тем самым адсорбируя ДНК. Силиконовая мембрана избирательно адсорбирует ДНК в условиях высокого содержания солей и низкого pH., а силиконовая мембрана высвобождает ДНК в условиях с низким содержанием соли и высоким pH., .

5. Экстракция нуклеиновых кислот методом магнитных шариков

Молекулы ДНК связываются с положительно заряженными молекулами (такие как положительно заряженные химические группы) на поверхности магнитные бусины через их отрицательно заряженные фосфатные цепи посредством электростатического связывания при определенном pH, концентрация соли, и температура. Эта привязка специфична, обеспечение того, что только целевые молекулы ДНК связываются с магнитными шариками. В некоторых случаях, например, когда ПЭГ (полиэтиленгликоль) и ионы соли добавляются, конформация молекул ДНК претерпевает резкие изменения. Линейное состояние сжимается в скрученное сферическое состояние., что облегчает связывание ДНК с магнитными шариками. В то же время, Молекулы ДНК разной длины подвергаются избирательному осаждению под действием ПЭГ и ионов соли., таким образом добиваясь разделения фрагментов ДНК разного размера.

Метод двойной магнитной бусины: Это технология, разработанная на основе принципа экстракции плазмид., использование двух типов магнитных бусин с разными функциями. Магнитный шарик I используется для удаления бактериального мусора после лизиса., в то время как магнитная гранула II используется для специфического разделения молекул нуклеиновой кислоты.. Под действием лизирующего буфера, SDS сочетается с бактериальным остатком, белки, и другие примеси с образованием нерастворимого калия (или натрий) комплекс осадка солей, который имеет положительный заряд за счет соединения большого количества K⁺ (или На⁺). Магнитная бусина I, с большим количеством отрицательно заряженных магнитных шариков из поликарбоксилата, может специфически адсорбировать примеси посредством электростатической адсорбции и координации с положительно заряженным K⁺ (или На⁺) сложный. Магнитный шарик II имеет поверхность, модифицированную большим количеством силанольных групп., который может специфически адсорбировать нуклеиновые кислоты в среде спиртового растворителя, основанный на этом принципе, может быть достигнуто специфическое разделение плазмидной ДНК.

Плазмидную ДНК можно эффективно отделить от клеток-хозяев, а ее чистоту и целостность можно обеспечить вышеуказанными методами., заложить прочную основу для последующих экспериментов по молекулярной биологии.

Поставщик

Шанхайская биотехнологическая компания Линцзюнь., ОООбыл создан в 2016 который является профессиональным производителем биомагнитных материалов и реагентов для экстракции нуклеиновых кислот..

Мы имеем богатый опыт в экстракции и очистке нуклеиновых кислот., очистка белка, разделение клеток, хемилюминесценция и другие области техники.

Наша продукция широко используется во многих областях., например, медицинское тестирование, генетическое тестирование, университетские исследования, генетическое разведение, и так далее. Мы не только поставляем продукцию, но и можем взять на себя OEM, ОДМ, и другие потребности. Если у вас есть соответствующие потребности, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам по адресуsales01@lingjunbio.com.