Cara Membedakan DNA Plasmid dari DNA Kromosom Selama Ekstraksi?

Ekstraksi DNA plasmid adalah teknik mendasar dan penting dalam penelitian biologi molekuler. Kunci membedakan DNA plasmid dengan DNA kromosom terletak pada perbedaan sifat fisik dan kimianya. Berikut beberapa metode umum untuk diferensiasi.

1. Lisis Alkalin

Lisis basa adalah salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk ekstraksi DNA plasmid. Prinsipnya didasarkan pada perbedaan struktur topologi antara DNA kromosom dan DNA plasmid. Dinding sel bakteri dan membran sel terganggu dalam lingkungan basa kuat, melepaskan DNA kromosom dan DNA plasmid. Struktur heliks ganda DNA linier dihancurkan dan didenaturasi, sedangkan DNA plasmid sirkular tertutup secara kovalen, meskipun terdenaturasi dalam kondisi basa kuat(pH 12.6) kondisi, masih memiliki dua untaian pelengkap yang saling terkait dan terkait erat. Ketika pH 4,8 asetat kalium(atau natrium asetat) larutan buffer garam tinggi ditambahkan untuk mengembalikan netralitas, DNA plasmid sirkular yang tertutup secara kovalen mengalami renaturasi dengan cepat, sementara DNA kromosom linier mengalami rekondisi secara perlahan. Protein bakteri, dinding sel pecah, dan DNA kromosom yang terdenaturasi akan terjerat menjadi kompleks yang besar, yang ditutupi oleh natrium dodesil sulfat(SDS). DNA plasmid dapat diperoleh kembali dari supernatan setelah sentrifugasi untuk menghilangkan denaturant.

2. Lisis Mendidih

Lisis mendidih sangat cocok untuk plasmid kecil yang berukuran kurang dari 15 kb. Metode ini melibatkan suspensi bakteri dalam buffer yang mengandung Triton X-100 dan lisozim yang dapat mencerna dinding sel., kemudian dipanaskan hingga 100°C hingga menyebabkan lisis. Pemanasan tidak hanya menghancurkan dinding sel tetapi juga membantu mengurai pasangan basa untai DNA dan mengubah sifat protein dan DNA kromosom.. DNA plasmid sirkular tertutup tidak terpisah satu sama lain karena tulang punggung fosfodiesternya terjalin dalam struktur topologi.. Saat suhu turun, basa DNA sirkular tertutup kembali ke posisinya, membentuk molekul superkoil. DNA plasmid dapat diperoleh kembali dari supernatan setelah sentrifugasi untuk menghilangkan nukleoprotein kromosom yang terdenaturasi.

3. Ekstraksi Satu Langkah Persiapan Mini

Ekstraksi satu langkah persiapan mini didasarkan pada fakta bahwa DNA kromosom bakteri jauh lebih besar daripada DNA plasmid. DNA kromosom bakteri dipotong menjadi fragmen linier dengan ukuran berbeda yang melekat pada puing-puing sel dan menjadi terdenaturasi karena tekanan mekanis.. Meskipun DNA plasmid juga mengalami denaturasi, ia berubah sifat dengan cepat setelah gaya mekanisnya menghilang, masih tersisa larut dalam larutan, sementara DNA kromosom bakteri mengalami rekondisi secara perlahan, membentuk struktur retikuler yang tidak larut. DNA plasmid dapat dipisahkan dengan sentrifugasi berkecepatan tinggi.

4. Penerapan Kolom Pemurnian

Kolom pemurnian umumnya terdiri dari lapisan membran silikon,  yang selektif dapat mengadsorpsi DNA, dan proses ini dapat dibalik. Gugus silanol pada permukaan membran silikon menjadi bermuatan negatif setelah disosiasi dalam larutan, membentuk jembatan listrik dengan ion garam bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif, sehingga menyerap DNA. Membran silikon secara selektif mengadsorpsi DNA pada kondisi pH rendah garam tinggi, dan membran silikon melepaskan DNA dalam kondisi pH rendah garam tinggi, .

5. Ekstraksi asam nukleat dengan metode magnetic bead

Molekul DNA berikatan dengan molekul bermuatan positif (seperti gugus kimia yang bermuatan positif) di permukaan manik-manik magnetik melalui tulang punggung fosfat bermuatan negatif melalui pengikatan elektrostatik pada pH tertentu, konsentrasi garam, dan suhu. Pengikatan ini bersifat spesifik, memastikan bahwa hanya molekul DNA target yang mengikat manik-manik magnetik. Dalam beberapa kasus, seperti kapan PASAK (polietilen glikol) dan ion garam ditambahkan, konformasi molekul DNA mengalami perubahan drastis. Keadaan linier dikompresi menjadi keadaan bola melengkung, yang membuat DNA lebih mudah diikat dengan manik-manik magnetik. Pada saat yang sama, Molekul DNA dengan panjang berbeda mengalami pengendapan selektif di bawah aksi PEG dan ion garam, sehingga mencapai pemisahan fragmen DNA dengan ukuran berbeda.

Metode Manik Magnetik Ganda: Ini adalah teknologi yang dikembangkan berdasarkan prinsip ekstraksi plasmid, menggunakan dua jenis manik magnet dengan fungsi berbeda. Manik magnetik I digunakan untuk menghilangkan sisa-sisa bakteri setelah lisis, sedangkan manik magnetik II digunakan untuk pemisahan spesifik molekul asam nukleat. Di bawah aksi buffer lisis, SDS bergabung dengan sisa-sisa bakteri, protein, dan kotoran lainnya untuk membentuk kalium yang tidak larut (atau natrium) kompleks endapan garam, yang bermuatan positif akibat kombinasi K dalam jumlah besar⁺ (atau Na⁺). Manik magnet I, dengan sejumlah besar manik-manik magnet polikarboksilat bermuatan negatif, secara khusus dapat menyerap kotoran melalui adsorpsi elektrostatik dan koordinasi dengan K yang bermuatan positif⁺ (atau Na⁺) complex. Magnetic bead II has a surface modified with abundant silanol groups, which can specifically adsorb nucleic acids in an alcohol solvent environment, based on this principle, the specific separation of plasmid DNA can be achieved.

Plasmid DNA can be effectively separated from the host cells and its purity and integrity can be ensured by the above methods, laying a solid foundation for subsequent molecular biology experiments.

Pemasok

Shanghai Lingjun Bioteknologi Co., Ltd.didirikan pada 2016 yang merupakan produsen profesional bahan biomagnetik dan reagen ekstraksi asam nukleat.

Kami memiliki pengalaman yang kaya dalam ekstraksi dan pemurnian asam nukleat, pemurnian protein, pemisahan sel, chemiluminescence dan bidang teknis lainnya.

Produk kami banyak digunakan di berbagai bidang, misalnya tes kesehatan, pengujian genetik, penelitian universitas, pemuliaan genetik, dan sebagainya. Kami tidak hanya menyediakan produk tetapi juga dapat melakukan OEM, ODM, dan kebutuhan lainnya. Jika Anda memiliki kebutuhan terkait, jangan ragu untuk menghubungi kami dipenjualan01@lingjunbio.com.