Comment distinguer l'ADN plasmidique de l'ADN chromosomique lors de l'extraction?

Extraction d'ADN plasmidique est une technique fondamentale et importante dans la recherche en biologie moléculaire. La clé pour distinguer l’ADN plasmidique de l’ADN chromosomique réside dans leurs différences de propriétés physiques et chimiques.. Voici plusieurs méthodes courantes de différenciation.

1. Lyse alcaline

La lyse alcaline est l'une des méthodes les plus utilisées pour l'extraction de l'ADN plasmidique.. Son principe repose sur les différences de structure topologique entre l'ADN chromosomique et l'ADN plasmidique.. La paroi cellulaire bactérienne et la membrane cellulaire sont perturbées dans un environnement fortement alcalin, libérant de l'ADN chromosomique et de l'ADN plasmidique. La structure linéaire en double hélice de l’ADN est détruite et dénaturée, tandis que l'ADN plasmidique circulaire fermé de manière covalente, bien que dénaturé sous forte alcaline(pH 12.6) conditions, comporte toujours deux volets complémentaires, entrelacés et étroitement associés. Lorsque pH 4,8 acétate de potassium(ou acétate de sodium) une solution tampon à haute teneur en sel est ajoutée pour restaurer la neutralité, L'ADN plasmidique circulaire fermé de manière covalente se renature rapidement, tandis que l'ADN chromosomique linéaire se renature lentement. Protéines bactériennes, parois cellulaires rompues, et l'ADN chromosomique dénaturé s'enchevêtrera dans de grands complexes, qui sont recouverts de dodécylsulfate de sodium(FDS). L'ADN plasmidique peut être récupéré du surnageant après centrifugation pour éliminer le dénaturant.

2. Lyse bouillante

La lyse par ébullition est particulièrement adaptée aux petits plasmides de moins de 15 ko. Cette méthode consiste à suspendre les bactéries dans un tampon contenant du Triton X-100 et du lysozyme capable de digérer la paroi cellulaire., puis chauffer à 100°C pour provoquer la lyse. Le chauffage détruit non seulement la paroi cellulaire, mais aide également à démêler l'appariement des bases des brins d'ADN et à dénaturer les protéines et l'ADN chromosomique.. L'ADN plasmidique circulaire fermé ne se sépare pas les uns des autres car leurs squelettes phosphodiester sont entrelacés dans une structure topologique. Quand la température baisse, les bases de l'ADN circulaire fermé reviennent à leurs positions, formant une molécule superenroulée. L'ADN plasmidique peut être récupéré du surnageant après centrifugation pour éliminer les nucléoprotéines chromosomiques dénaturées..

3. Extraction en une étape Mini-Prep

L'extraction en une étape par mini-préparation est basée sur le fait que l'ADN chromosomique bactérien est beaucoup plus gros que l'ADN plasmidique.. L'ADN chromosomique bactérien est divisé en fragments linéaires de différentes tailles qui adhèrent aux débris cellulaires et se dénaturent sous l'effet d'une force mécanique.. Bien que l'ADN plasmidique soit également dénaturé, il renature rapidement après disparition de la force mécanique, restant soluble dans la solution, tandis que l'ADN chromosomique bactérien se renature lentement, formant une structure réticulaire insoluble. L'ADN plasmidique peut être séparé par centrifugation à grande vitesse.

4. Application des colonnes de purification

Les colonnes de purification sont généralement composées d'une couche de membrane silicone,  qui peut adsorber sélectivement l'ADN, et ce processus est réversible. Les groupes silanol à la surface de la membrane de silicone se chargent négativement après dissociation dans la solution, formant un pont électrique avec des ions de sel chargés positivement et de l'ADN chargé négativement, adsorbant ainsi l'ADN. La membrane en silicone adsorbe sélectivement l'ADN dans des conditions riches en sel et à faible pH., et la membrane en silicone libère de l'ADN dans des conditions de faible teneur en sel et de pH élevé., .

5. Extraction d'acide nucléique par méthode de billes magnétiques

Les molécules d'ADN se lient aux molécules chargées positivement (tels que les groupes chimiques chargés positivement) à la surface de perles magnétiques à travers leurs squelettes phosphates chargés négativement via une liaison électrostatique à un pH spécifique, concentration en sel, et la température. Cette liaison est spécifique, s'assurer que seules les molécules d'ADN cibles se lient aux billes magnétiques. Dans certains cas, comme quand CHEVILLE (polyéthylèneglycol) et des ions sel sont ajoutés, la conformation des molécules d'ADN subit des changements drastiques. L'état linéaire est compressé en un état sphérique courbé, ce qui rend l'ADN plus facile à lier avec des billes magnétiques. En même temps, Des molécules d'ADN de différentes longueurs subissent une précipitation sélective sous l'action du PEG et des ions sel., réalisant ainsi la séparation de fragments d'ADN de différentes tailles.

Méthode à double perle magnétique: Il s'agit d'une technologie développée sur la base du principe de l'extraction de plasmides, en utilisant deux types de billes magnétiques avec des fonctions différentes. La perle magnétique I est utilisée pour éliminer les débris bactériens après lyse, tandis que la perle magnétique II est utilisée pour la séparation spécifique des molécules d'acide nucléique. Sous l'action du tampon de lyse, Le SDS se combine avec les débris bactériens, protéines, et d'autres impuretés pour former un potassium insoluble (ou du sodium) complexe de précipité de sel, qui a une charge positive en raison de la combinaison d'une grande quantité de K⁺ (ou Na⁺). Perle magnétique I, avec un grand nombre de billes magnétiques en polycarboxylate chargées négativement, peut spécifiquement adsorber les impuretés par adsorption électrostatique et coordination avec le K chargé positivement⁺ (ou Na⁺) complexe. Magnetic bead II has a surface modified with abundant silanol groups, which can specifically adsorb nucleic acids in an alcohol solvent environment, based on this principle, the specific separation of plasmid DNA can be achieved.

Plasmid DNA can be effectively separated from the host cells and its purity and integrity can be ensured by the above methods, laying a solid foundation for subsequent molecular biology experiments.

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Société de biotechnologie Shanghai Lingjun., Ltd.a été établi en 2016 qui est un fabricant professionnel de matériaux biomagnétiques et de réactifs d'extraction d'acide nucléique.

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